微藻紅球藻以其生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品蝦青素的能力而聞名。蝦青素是一種葉黃素類胡蘿卜素，由于其強(qiáng)大的抗氧化和著色特性，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、營養(yǎng)品和化妝品等行業(yè)。然而，在規(guī)?；囵B(yǎng)這種微藻時(shí)，科研人員和生產(chǎn)者卻面臨著一個(gè)棘手的問題。紅球藻的生產(chǎn)通常采用兩階段培養(yǎng)法：第一階段是“vegetative phase”，在適宜的光照條件下讓細(xì)胞快速增殖；第二階段是“induction phase”，通過高光、缺氮等脅迫條件誘導(dǎo)蝦青素積累。從溫和的低光環(huán)境突然被轉(zhuǎn)移到強(qiáng)光下時(shí)，紅球藻來不及適應(yīng)這種劇烈的光照變化，結(jié)果導(dǎo)致光系統(tǒng)受損、細(xì)胞死亡、藻液褪色、生物量銳減。

　　近期，中科院海洋所的劉建國課題組發(fā)現(xiàn)了一個(gè)簡(jiǎn)單而有效的解決方案：在光照轉(zhuǎn)換前的暗期，向培養(yǎng)基中添加谷氨酸（GU）或谷氨酰胺（GN），紅球藻的死亡率從41.49%驟降至3%以下。其研究結(jié)果“Glutamate and Glutamine Enable Rapid Acclimation of Haematococcus lacustris to High‐Light During Culture Phase Shift by Pre-Activating Photoprotective Pathways”發(fā)表在《Plant, Cell & Environment》期刊上。該研究中，使用英國Hansatech公司生產(chǎn)的Handy PEA、FMS-2和M-PEA測(cè)定了OJIP曲線及參數(shù)、葉綠素?zé)晒獯銣?、環(huán)式電子傳遞、葉綠體呼吸、光呼吸及PSⅠ活性等指標(biāo)，并結(jié)合蛋白表達(dá)和代謝物水平，系統(tǒng)闡述了外源GU/GN通過預(yù)先激活紅球藻光保護(hù)機(jī)制，幫助其快速適應(yīng)高光脅迫的機(jī)理。

　　外源施加GU或GN后，藻細(xì)胞死亡率驟降，且細(xì)胞密度均顯著高于對(duì)照。PSⅡ的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）是光抑制/光損失的關(guān)鍵指標(biāo)。強(qiáng)光處理后，GU組和GN組的Fv/Fm值顯著高于CK組。結(jié)果表明，谷氨酸和谷氨酰胺有效地減輕了連續(xù)強(qiáng)光暴露引起的光抑制，防止細(xì)胞漂白和細(xì)胞密度下降，從而加速了紅球藻的生長。

　　在整個(gè)試驗(yàn)期間，GU組和GN組PSII實(shí)際光化學(xué)效率（φPSII）均高于CK組。光適應(yīng)的最大光化學(xué)效率（Fv′/Fm′）和光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）反映了天線能量轉(zhuǎn)換的最大潛在效率和開放的PSII反應(yīng)中心比例。GU和GN組的Fv′/Fm′在最初1h顯著高于CK組；強(qiáng)光處理1h后，CK組qP明顯下降，GU組和GN組qP下降幅度明顯較小，且qP值明顯高于CK組。這表明，外源GU和GN提高紅球藻光合能力的主要原因是阻止了PSII反應(yīng)中心的關(guān)閉，而GN組的Fv/Fm和φPSII值最高，說明外源GN的光保護(hù)作用比GU強(qiáng)。

　　圖1 外源GU和GN對(duì)紅球藻細(xì)胞生長和光合性能的影響OJIP曲線的形狀和820nm曲線的變化分別與PSII和PSI的活動(dòng)密切相關(guān)。強(qiáng)光照射6h后，CK組OJIP曲線振幅明顯下降，GU和GN組的OJIP曲線變化較小。820nm曲線顯示三種處理在高光處理下PSI的活性不受影響。這表明，強(qiáng)光處理期間紅球藻的光抑制發(fā)生在PSII，而GU和GN可以緩解這種光抑制。

　　圖2 強(qiáng)光處理和恢復(fù)后PSII和PSI活性的變化強(qiáng)光處理后，各處理組每個(gè)PSII活性反應(yīng)中心的光吸收通量（ABS/RC）隨時(shí)間逐漸增加，但每個(gè)PSII活性反應(yīng)中心的激發(fā)能捕獲通量（TRo/RC）最初增加，然后減少。每個(gè)PSII活性反應(yīng)中心的電子傳遞通量（ETo/RC）和每個(gè)PSII活性反應(yīng)中心的耗散通量（DIo/RC）分別逐漸減少和增加。這表明，大部分的激發(fā)能量沒有被捕光天線傳給反應(yīng)中心并用于電子傳遞，而是被耗散了。與CK組相比，GU和GN組這些參數(shù)的變化更溫和些。強(qiáng)光處理6h后，GN組的TRo/RC和ETo/RC明顯高于CK組。此外，GU和GN組電子傳遞量子產(chǎn)率（φEo）和超過QA的電子傳遞效率（ψo(hù)）明顯高于CK組，表明GU和GN在相移后的強(qiáng)光下具有更大的光合電子傳遞能力。K階（WK）和J階（VJ）處相對(duì)可變熒光的變化通常反映了PSII供體側(cè)（放氧復(fù)合物OEC）和PSII受體側(cè)（QA-QB）的狀態(tài)。GU和GN組的WK和VJ均顯著低于CK組，表明外源GU和GN在一定程度上維持了紅球藻PSII的穩(wěn)定性，減輕了強(qiáng)光對(duì)供體和受體側(cè)的傷害。更重要的是，GU和GN組在相移突變后表現(xiàn)出對(duì)強(qiáng)光的有效適應(yīng)，從而防止了光能吸收和利用的失衡，這表明GU和GN在相移突變前的暗適應(yīng)階段就已經(jīng)激活了光保護(hù)策略。

　　性能指數(shù)PIABS與光合機(jī)構(gòu)的能量守恒和活性密切相關(guān)，代表光合性能的最敏感指標(biāo)，因?yàn)樗狭斯馕招剩≧C/ABS）、初級(jí)光化學(xué)的量子效率相關(guān)的性能[φPo/（1-φPo）]和將激發(fā)能轉(zhuǎn)換成電子傳輸?shù)牧孔有氏嚓P(guān)的性能[ψo(hù)/(1 ? ψo(hù))]。GU和GN組的PIABS顯著高于CK組，這表明，外源GU和GN有效地提高了強(qiáng)光下紅球藻的光合能量利用能力和效率，從而提高了湖藻在光相轉(zhuǎn)換過程中的耐受性。另外，短期暴露于強(qiáng)光下引起的光損傷是可逆和可恢復(fù)的。但GU和GN在促進(jìn)光損傷恢復(fù)方面沒有發(fā)揮作用。

　　圖3 高光處理和恢復(fù)下紅球藻葉綠素a熒光參數(shù)的變化根據(jù)代謝結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源性GU和GN賦予紅球藻對(duì)突然強(qiáng)光暴露的快速適應(yīng)能力不依賴于細(xì)胞內(nèi)代謝調(diào)節(jié)（圖4）。蛋白質(zhì)豐度的結(jié)果表明，谷氨酸和谷氨酰胺可能通過調(diào)節(jié)光合機(jī)構(gòu)蛋白表達(dá)以外的機(jī)制發(fā)揮其光保護(hù)作用。但卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶-核酮糖二磷酸羧化酶（Rubisco）在GU組中的蛋白質(zhì)豐度顯著高于CK組而GN組與CK組之間無顯著差異。推測(cè)外源GU促進(jìn)紅球藻CO2固定，使光合電子產(chǎn)生的NADPH及時(shí)耗盡，從而防止了過量NADPH的累積而加劇光抑制（圖5）。

　　圖4 外源添加GU和GN后紅球藻的代謝變化

　　圖5 高光處理下光合機(jī)構(gòu)蛋白質(zhì)水平的變化考慮到上述結(jié)果排除了代謝調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)在GU和GN減輕光損傷中的作用，因此推測(cè)光保護(hù)途徑可能起主導(dǎo)作用。非光化學(xué)淬滅NPQ可以將多余的吸收光能作為熱量耗散，這是由質(zhì)子梯度（ΔpH）的建立和葉黃素循環(huán)的活性觸發(fā)的。強(qiáng)光照射后，GU和GN組的NPQ明顯高于CK組。這表明外源GU和GN能促進(jìn)紅球藻的NPQ，且蛋白質(zhì)豐度增加，與其NPQ活性變化一致。環(huán)式電子傳遞（CEF）和葉綠體呼吸被認(rèn)為在調(diào)節(jié)光合作用和減輕光損傷方面起著關(guān)鍵作用。CEF分為CEF-PSII和CEF-PSI。在三組試驗(yàn)中，CEF-PSII無明顯變化。GU和GN在相移前均顯示出升高的CEF-PSI活性，但CK組在強(qiáng)光處理6h后才表現(xiàn)出升高的CEF-PSI活性。在強(qiáng)光暴露前，GU和GN的葉綠體呼吸活性明顯高于CK組。這些結(jié)果表明，外源性GU和GN胺迅速觸發(fā)替代電子流（AEF），包括CEF-PSI和氯呼吸，幫助紅球藻在相移期間消耗多余的激發(fā)能量。輕微的差異是GU在促進(jìn)CEF-PSI方面更有效，而GN優(yōu)先促進(jìn)葉綠體呼吸。

　　圖6 強(qiáng)光處理下紅球藻光保護(hù)途徑活性的變化綜上所述，在相移前補(bǔ)充GU和GN可緩解突發(fā)強(qiáng)光脅迫對(duì)紅球藻的光損傷。GU可迅速增強(qiáng)CO2固定，同時(shí)誘導(dǎo)多種光保護(hù)途徑，包括非光化學(xué)猝滅、循環(huán)電子流、葉綠體呼吸和光呼吸，從而維持紅球藻在突發(fā)環(huán)境轉(zhuǎn)變期間光吸收和能量利用之間的平衡，從而防止PSII供體側(cè)和受體側(cè)的損傷。在黑暗中谷氨酸預(yù)激活了這些光保護(hù)途徑，從而在相移突變后能夠無縫適應(yīng)強(qiáng)光脅迫。同時(shí)，GN在誘導(dǎo)多種光保護(hù)途徑方面表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)墓π?。這些發(fā)現(xiàn)為研究微藻和高等植物在快速環(huán)境變化下的光保護(hù)馴化機(jī)制提供了理論依據(jù)。

　　圖7 外源GU和GN如何減輕強(qiáng)光下紅球藻光抑制的示意圖