[研究方法│新應用│PEA] 使用Handy PEA+測定快速光曲線（RLCs）

　　一、概述

　　自20世紀90年代末以來，快速光曲線（RLCs）已被廣泛應用于光合作用研究，其主要使用脈沖調制式熒光儀測定。本應用指南描述的是如何使用Hansatech公司的植物效率分析儀Handy PEA+（連續(xù)激發(fā)式熒光儀）測定RLCs。

　　二、光合作用研究中的光曲線

　　多年來，各種類型的光曲線一直被用于光合性能的研究，因為它們可以評估植物當前的光合能力以及在環(huán)境光強范圍內的潛在活性（Ralph & Gademann, 2005）。

　　傳統(tǒng)上的光合-光強響應曲線（或P-E曲線，圖1）是通過測量不同環(huán)境光強下的放氧速率或碳固定速率獲取的。

　　圖1 光合-光強響應曲線α斜率代表最大的光能利用效率，α斜率與光合作用最大值Pmax的交點代表最小飽和光強（Ik或Ek），反映植物對強光的耐受能力。

　　在超過最適光強后，光合速率下降（虛線部分），這種部分通常被稱為光抑制或下調（Masojídek，2021）。

　　穩(wěn)態(tài)光曲線（SSLCs）是一種基于葉綠素熒光的測量協(xié)議繪制的電子傳遞速率（ETR）與光量子通量密度（PPFD）的函數(shù)曲線，并可與傳統(tǒng)的P-E曲線相媲美（Houliez et al., 2017）。

　　SSLCs從低光強至高光強依次測量光合速率。每一梯度的時間需要足夠長，以便達到在這一梯度的穩(wěn)態(tài)光合速率。完成SSLCs協(xié)議通常需要幾分鐘到幾小時的時間。在野外條件下，當比較不同植物之間的結果時，這就帶來了巨大的挑戰(zhàn)，因為必須考慮到不同的因素，如測量時間、植物節(jié)律和天氣變化等（Rascher et al., 2000）。

　　快速光曲線（RLCs）由一系列時間相對較短（＜30s，通常為10s）的光強梯度組成，每一個梯度的光強依次增強（光強梯度由低到高）。各個梯度之間開飽和閃光測定ETR。與P-E光響應曲線或SSLCs不同，RLCs協(xié)議在各個光照梯度上不會達到穩(wěn)態(tài)光合速率。P-E曲線顯示的是與光反應無關的光合性能的最佳狀態(tài)，RLCs顯示的則是光合性能的當前狀態(tài)。由于在RLCs中沒有達到穩(wěn)態(tài)條件，它們反映了在測量之前時期的光適應狀態(tài)，也反映了較長期的光反應（Ralph & Gademann, 2005）。

　　除了總體光合性能外，RLCs還可提供與通過光系統(tǒng)II（PSII）的電子傳輸飽和特性相關的詳細信息（Ralph and Gademann, 2005）。

　　用ETR與PPFD作圖得RLCs，RLCs中顯示三個不同的階段（圖2）。

　　1 光限制階段

　　在該階段，光合速率受低光照水平的限制。參數(shù)α是ETR相對于PPFD上升的斜率，且其與光捕獲效率（有效量子產(chǎn)率或φPSII）成正比（Schreiber, 2004）。

　　2 光飽和階段

　　在該階段，電子傳遞鏈的容量限制了電子傳遞速率。RLCs在ETR達到最大值時達到平臺期（用參數(shù)ETRmax表示）（Schreiber, 2004）。最小飽和光強用參數(shù)Ek（或Ik）表示，由α與ETRmax的截距確定（Sakshaug,1997），其與淬滅相關。在Ek以下，光化學淬滅是主要途徑，而在Ek以上，非光化學淬滅是主要途徑（Henley, 1993）。

　　3 光抑制/下調階段

　　在這個區(qū)域，植物受到超飽和光強的照射，RLCs往往趨于下降趨勢，這可能與光抑制有關（Henley, 1993）。這種下降效應更可能發(fā)生在傳統(tǒng)的P-E曲線或SSLCs中，因為它們的光合速率達到了穩(wěn)態(tài)。而RLCs中沒有達到穩(wěn)態(tài)，通常沒有足夠的時間發(fā)生光損傷。有人認為，在超飽和光強下ETR的下降可能與PSII的動態(tài)下調有關（White and Critchley, 1999）。

　　圖2 RLCs的三個階段A-光限制階段；B-光飽和階段；C-光抑制/下調階段

　　三、快速光曲線的測定

　　RLCs協(xié)議通常以不超過10秒的初始準黑暗期開始。這允許初級電子受體（QA）的快速再氧化，而非光化學淬滅系數(shù)沒有實質性的弛豫（Schreiber, 2004）。這與長時間的完全暗適應期形成對比，如在快速葉綠素熒光誘導曲線測量中使用的幾分鐘或更長時間的暗適應。在完全的暗適應下，光反應和暗反應變得不活躍，導致光系統(tǒng)的完全再氧化（Rascher et al., 2000）。如果PSI和PSII發(fā)生完全的再氧化，RLCs協(xié)議中的照明將產(chǎn)生誘導效應，使數(shù)據(jù)的解釋更加復雜。

　　準黑暗期之后緊接著是一個飽和閃光。隨后是一個逐步增加的光化周期梯度，每個周期之后是一個飽和閃光。光化周期的典型持續(xù)時間為每個10秒。

　　光化光梯度的理想設置是在光限制、光飽和與光抑制三個區(qū)域中的每一個區(qū)域都生成幾個數(shù)據(jù)點。對于弱光條件下光合作用更強的樣品，在光限制區(qū)域測量更多的數(shù)據(jù)點有利于更好地估計α參數(shù)。如果樣品耐強光，那么在光飽和與光抑制區(qū)域測量更多的數(shù)據(jù)點將提供更有趣的結果。

　　四、使用Handy PEA+測定RLCs

　　Handy PEA+軟件的協(xié)議編輯器，特別是其預照光功能，可用于測量與非調制式熒光儀相關的更典型參數(shù)和協(xié)議，如φPSII (Y(II))，ETR，NPQ和淬滅分析模型等。

　　您可以在Hansatech公司網(wǎng)站（Support>Applications）上下載提供的示例協(xié)議開始RLC測量。或者您可以安裝和修改示例協(xié)議，也可以從頭創(chuàng)建協(xié)議。網(wǎng)址為http://www.hansatech-instruments.com/hil-application-notes/。

　　關于命名法有一個重要的提示。因為Handy PEA+的控制和分析軟件PEA plus目前假定已經(jīng)執(zhí)行了一個暗適應協(xié)議，它將默認地對其分析工具中的測量參數(shù)應用暗適應命名法。

　　Hansatech公司網(wǎng)站上提供了一個Excel表格，用于執(zhí)行解釋RLCs數(shù)據(jù)所需的圖形和統(tǒng)計分析。在將Handy PEA+數(shù)據(jù)導出到電子表格后，可以根據(jù)表1進行相應的參數(shù)命名調整轉換。

表1 使用Handy PEA+測定的RLC參數(shù)默認命名的轉換

　　使用示例協(xié)議

　　1 下載示例協(xié)議到您的電腦；

　　2 將Handy PEA+連接到電腦；

　　3 打開電腦上的PEA plus軟件；

　　4 通過“Handy PEA>Select Com Port”菜單選項，選擇電腦給Handy PEA+分配的com端口；

　　5 通過“Handy PEA>Protocol Editor”菜單選項，打開Protocol Editor協(xié)議編輯器；

　　6 在Protocol Editor協(xié)議編輯器中，選擇“File>Open”；

　　7 導航至電腦上的示例協(xié)議，點擊“Open”；

　　8 在Protocol Editor協(xié)議編輯器的左側，點擊“Setup”按鈕；

　　9 進入“Multi Recording”窗口，在“Before Recording”區(qū)域的“illumination”定義RLCs的光化光梯度光強。

圖3 Protocol Editor協(xié)議編輯器中的Multi Recording窗口

　　10 在Protocol Editor協(xié)議編輯器的左側，點擊“Upload”按鈕；

　　11 在Handy PEA+上選擇一個可用的協(xié)議位并接受；

　　12 在Handy PEA+儀器上選擇并運行協(xié)議。

　　從頭創(chuàng)建RLC協(xié)議

　　請按照以下步驟在PEA plus軟件中創(chuàng)建RLC協(xié)議。

　　1 在PEA plus軟件中，打開Handy PEA+協(xié)議編輯器；

　　2 點擊“Title”按鈕并定義協(xié)議的名稱；

　　3 點擊“Gain”按鈕，為您的協(xié)議調整增益至合適的水平，默認為1；

　　4 在Protocol Editor協(xié)議編輯器的左側，勾選“Multi Recording”選項，并選擇RLC所需的記錄數(shù)量（即光化光梯度）；

　　5 將“Before Recording”中的“Duration”設置為＜30s（推薦10s）；

　　6 將Number1對應的illumination數(shù)值設置為0，來實現(xiàn)準黑暗期；

　　7 在隨后的illumination框中，設置一組光化光梯度光強，以覆蓋光限制、光飽和光抑制三個區(qū)域；

　　8 在“Recording”區(qū)域，將“Duration”設置為1s；

　　9 在“Recording”區(qū)域，將所有illumination數(shù)值設置為＞3000umol/m2/s；

　　10 將協(xié)議上傳至Handy PEA+。

　　運行RLC協(xié)議

　　1 在Handy PEA+儀器上，導航到協(xié)議菜單（System>Protocol），選擇上傳的協(xié)議進行查看設置；

　　2 點擊“Reset”按鈕，返回主菜單；

　　3 通過“System>Configure>More”導航至警報設置界面，將Warnings改為No。因為RLC測量過程除了最初的飽和脈沖測量之外，后續(xù)測量都將出現(xiàn)較低的Fm和Fv/Fm，這是必然的，所以測量警報是不必要的；

　　4 確保其他所有設置，如ID Entry，Gain，Autosave等設置符合您的實驗要求；

　　5 在所測樣品上放置Handy PEA+暗適應葉夾，不要關閉遮光片，因為光系統(tǒng)的完全再氧化會導致RLC產(chǎn)生誘導效應，是數(shù)據(jù)更加復雜（Rascher et al., 2000）；

　　6 將Handy PEA+探頭安裝到葉夾上，并盡快開始測量，以避免樣品長時間的暗適應，測量過程中要確保樣品穩(wěn)定地保持在葉夾內的位置上；

　　7 測量完成后，依次保存數(shù)據(jù)，并將Handy PEA+連接到電腦下載記錄的數(shù)據(jù)。

　　分析RLC數(shù)據(jù)

　　如上所述，PEA plus軟件默認測量數(shù)據(jù)已經(jīng)執(zhí)行了暗適應，并在此基礎上應用命名法。在RLC協(xié)議期間測量的數(shù)據(jù)來自光適應后的樣品，因此，對于協(xié)議期間進行的每一次測量，PEA plus軟件中顯示的參數(shù)應當重新標記，如表1。

　　PEA plus軟件目前不提供解釋RLC數(shù)據(jù)所需的圖形和統(tǒng)計分析。但是，Hansatech公司網(wǎng)站上提供一個Excel表格，Handy PEA+測量的RLC數(shù)據(jù)可復制粘貼至其中，進行處理。

　　RLC模板采用Platt等人（1980）的方程將Handy PEA+測量的原始數(shù)據(jù)建模曲線。該模板要求在Excel中啟用解算器插件。解算器插件使用GRG非線性方法最小化誤差平方和（SSE），用于計算最佳解/擬合。

　　該模板包括一些示例RLC分析工作表，以供參考（圖4）。

圖4 RLC數(shù)據(jù)處理模板

　　該模板可從Hansatech網(wǎng)站的“Support>Applications”頁面下載。網(wǎng)址為具體操作步驟如下。

　　1 確保PEA plus軟件的Summary選項卡內顯示來自RLC協(xié)議的所有測量記錄；

　　2 打開Parameters選項卡，確保顯示參數(shù)Fo和Fm。如果未顯示，可通過“Tools>’Parameter View’Parameters”啟用；

　　3 將空白RLC模板復制到新的工作表中；

　　4 在“Measured parameters”下的F（Fs）這一列內輸入對應的Fo；

　　5 在“Measured parameters”下的Fm’這一列內輸入對應的Fm；

　　6 在“Measured parameters”下的PAR這一列輸入PEA plus軟件的Settings選項卡內對應的“P.Light”，如果未顯示“P.Light”，則在PEA plus軟件左側的“Preferences”區(qū)域勾選“l(fā)p”即可顯示；

　　7 φPSII和ETR的值是自動計算的，ETR是使用單元格B8和B9中定義的常數(shù)來計算的，PFDa和FractionPSII分別設置為0.84和0.5，如果有需要，可更改；

　　8 依次將“Measured parameters”下的PAR、F（Fs）和Fm’對應的P.Light、Fo和Fm輸入，φPSII和ETR將自動計算完畢；

　　9 點擊“Plot curve”按鈕運行解算器，這將最小化誤差平方和（SSE），并生成一條曲線，ETRs、α、β、ETRmax和Ek的最佳擬合值也被計算出。

　　參考文獻：

　　1 BAKER NR. (2008). Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology 59, 89–113.2 HENLEY WJ (1993). Measurement and interpretation of photosynthetic light-response curves in algae in the context of photoinhibition and diel changes. J Phycol 29:729–7383 HOULIEZ, E., LEFEBVRE, S., LIZON, F., SCHMITT, F.G., (2017). Rapid light curves (RLC) or non?sequential steady?state light curves (N?SSLC): which fluorescence?based light response curve methodology robustly characterizes phytoplankton photosynthetic activity and acclimation status? Mar Biol (2017) 164:1754 MASOJíDEK, J.; RANGLOVá, K.; LAKATOS, G.E.; SILVA BENAVIDES, A.M.; TORZILLO, G. (2021). Variables Governing Photosynthesis and Growth in Microalgae Mass Cultures. Processes, 9, 820.5 PLATT, T., GALLEGOS, C.L., HARRISON, W.G. (1980). Photoinhibition of photosynthesis in natural assemblages of marine phytoplankton. J. Mar. Res., 38: 687-4016 RALPH, P.J. & GADEMANN, R. (2005). Rapid light curves: a powerful tool to assess photosynthetic capacity. Aquat. Bot., 82: 222–237.7 RASCHER, U., LIEBIG, M., LüTTGE, U., (2000). Evaluation of instant light-response curves of chlorophyll fluorescence parameters obtained with a portable chlorophyll fluorometer on site in the field. Plant Cell Environ. 23, 1397–1405.8 SAKSHAUG, E., BRICAUD, A., DANDONNEAU, Y., FALKOWSKI, P.G., KIEFER, D.A., LEGENDRE, L., MOREL, A., PARSLOW, J., TAKAHSHI, M., (1997) Parameters of photosynthesis: definitions, theory and interpretation of results. J Plankton Res 19:1637–16709 SCHREIBER U (2004). Pulse-amplitude-modulation (PAM) fluorometry and saturation pulse method: an overview. In: Papageorgiou G, Govindjee (eds) Chlorophyll fluorescence: a signature of photosynthesis, vol 19. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 279–31910 WHITE, A.J., & CRITCHLEY, C. (1999). Rapid light curves: a new fluorescence method to assess the state of the photosynthetic apparatus. Photosynth. Res., 59, 63–72.