上述分子的體現(xiàn)了降解劑的結(jié)構(gòu)與應(yīng)用類型的豐富性，但降解劑類分子的合理設(shè)計與不斷優(yōu)化以及活性檢測仍有很長的路要走。
“鐘” 模型與協(xié)同效應(yīng)
前文我們已經(jīng)介紹過，PROTAC 分子的設(shè)計之初，靶蛋白配體、E3 連接酶配體和兩者中間的連接子三者應(yīng)該分別考量。
在 PROTAC 介導(dǎo)的蛋白降解途徑中，其中靶標(biāo)配體 (POI)-PROTAC-E3 連接酶等三元復(fù)合物的有效形成同樣起到重要作用。三元復(fù)合物的任一單元的濃度改變帶來的不僅僅是線性變化，“鐘” 形模型常常被用來解釋這樣的活性與濃度相關(guān)性，文獻(xiàn)中提及的 hook effect 也正是形容這種情形。
另外，在活性研究中，協(xié)同效應(yīng) (cooperativity, α) 這一詞匯，被用于解釋 PROTAC 受 POI 與 E3 連接酶配體間蛋白蛋白相互作用 (PPI) 的影響。當(dāng) α 大于 1 時，POI 和 E3 是正協(xié)同效應(yīng)，對三元復(fù)合物的形成有利。
圖1. PROTAC 降解能力的“鐘”形模型與協(xié)同效應(yīng)示意圖[1]
不依賴泛素蛋白酶的降解體系
1. 依賴溶酶體途徑的降解類分子
PROTAC 主要依賴泛素-蛋白酶體途徑，其對應(yīng)降解的大多為胞質(zhì)蛋白與核蛋白。Bertozzi 教授的研究團(tuán)隊報道了一項靶向胞外蛋白的降解技術(shù)——溶酶體靶向嵌合體(LYTAC)。已證明LYTAC 成功降解了表皮生長因子受體 (EGFR)、程序性死亡配體1 (PD-L1)等膜上蛋白。對于細(xì)胞中一些非蛋白成分，Targeting lipid droplets for autophagic degradation by ATTEC一文展示了一種通過自噬束縛化合物 (ATTECs) 降解非蛋白質(zhì)生物分子的新策略，使用脂滴作為示例靶標(biāo)并成功降解。
圖2. ATTECs對脂滴的降解[5]LD·ATTECs 通過疏水作用與 LD 以及自噬體蛋白 LC3 結(jié)合，形成LD/TAG LD·ATTEC LC3三元復(fù)合物，復(fù)合物與自噬體溶酶體融合并最終被自噬體降解。
但不論是 PROTAC 還是上述其他方式，它們都靶向真核生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解，均不能在細(xì)菌和其他原核生物中發(fā)揮功能。
2. 依賴 ClpCP 酶的 BacPROTAC
今年 6 月，Morreale 團(tuán)隊等人在 Cell 發(fā)表的 BacPROTACs mediate targeted protein degradation in bacteria一文報道了一種用于革蘭氏陽性菌和分枝桿菌靶向蛋白降解的創(chuàng)新技術(shù)，BacPROTAC。
他們基于 Clausen 實驗室之前的一項發(fā)現(xiàn)：在枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽性菌中，AAA 去折疊酶 ClpC 和蛋白酶 ClpP 組成的 ClpC–ClpP (ClpCP) 蛋白酶是降解細(xì)菌中未折疊和聚集蛋白質(zhì)的重要蛋白水解酶。由于磷酸精氨酸的對接位點位于 ClpC ATP 酶的氨基末端結(jié)構(gòu)域，磷酸精氨酸 (pArg) 可作為 ClpCP 蛋白酶復(fù)合體的降解標(biāo)簽。
Morreale 等人報道的細(xì)菌 PROTACs (BacPROTACs) 由 POI 配體、Linker 和 ClpCNTDs配體組成，可誘導(dǎo)細(xì)菌這種沒有泛素蛋白酶體的非真核生物蛋白的體內(nèi)外降解。如圖 3A，研究團(tuán)隊在體外首先以單體鏈霉親和素 (mSA) 作為模型蛋白，通過 BacPROTAC將 pArg (ClpCNTD配體) 與生物素 (mSA 的配體) 結(jié)合，形成 BacPROTAC-1 三元復(fù)合物，有效降解靶蛋白。BacPROTAC-1 與 mSA 和 ClpCNTD結(jié)合的 KD為 3.9 和 2.8 μM (如圖 3C)。
圖 3. BacPROTAC-1 對枯草芽孢桿菌 ClpCP 的體外重編程[6]
由于磷精氨酸的化學(xué)穩(wěn)定性等方面存在問題，在體內(nèi)的應(yīng)用有限。作者團(tuán)隊將內(nèi)源性的磷酸化精氨酸殘基 (pArg) 換成了高選擇性的 sCym-1。sCym-1 不但可以和枯草芽孢桿菌的 ClpCP 結(jié)合，還可以與分歧桿菌的 ClpC1P1P2 結(jié)合。
圖4. BacPROTACs 對分枝桿菌 ClpC1P1P2 進(jìn)行重編程[6]
由于細(xì)胞生物素會競爭性與 mSA 結(jié)合，一定程度上阻礙 BacPROTAC 活性 (圖 5)，作者團(tuán)隊確定以 Bromodomain-1 (BD1) 作為更吸引人的模型底物，并將 JQ1 作為新的POI配體，天然環(huán)素 dCymM 作為 ClpCNTD 結(jié)合基團(tuán)。BacPROTACs 以濃度依賴性的方式促進(jìn) BRDTBD1的降解。
圖5. BacPROTACs 可以對分枝桿菌 ClpC1P1P2 進(jìn)行重編程[6]
上：BRDTBD1-directed BacPROTACs: 通過不同的 Linker 和連接位點連接 JQ1 到dCymM。下：分枝桿菌 ClpC1P1P2 與 BD1 孵育后降解的 SDS-PAGE 分析。
總之，如圖 6 所示：PROTACs 通過招募 E3 連接酶來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，E3 連接酶使得靶蛋白貼上泛素化標(biāo)簽，最后蛋白酶體降解泛素化的蛋白質(zhì)。
BacPROTACs 以高度特異的方式將細(xì)菌 ClpCP 蛋白酶定向到底物上，它不但可以誘導(dǎo)底物和蛋白酶之間的接近，并且通過結(jié)合誘導(dǎo)無活性的 ClpCP 十聚體重組為有活性的六聚體形式，直接啟動 ClpCP 水解靶標(biāo)蛋白。
圖 6. 蛋白質(zhì)降解的異雙功能方法[5]
沒有 Linker 的降解劑？
在降解劑分類里，分子膠(Molecular glues) 指同樣發(fā)揮誘導(dǎo)蛋白降解作用卻無 Linker 連接的一類分子，如Thalidomide、CC-92480、CC-90009 等結(jié)構(gòu)。分子膠在結(jié)構(gòu)上更接近傳統(tǒng)小分子,在膜透過性和生物利用度上更具優(yōu)勢，是 PROTAC 型降解劑的一個改造方向。
圖7. 分子膠的種類與降解劑類分子膠結(jié)構(gòu)
降解能力評價
降解劑的最終目的是降解相關(guān)的蛋白，無論是依賴泛素酶途徑的 PROTAC，依賴蛋白酶體途徑的 LYTAC，依賴 (ClpCP) 蛋白酶的 BacPROTAC。除 Kd 值測定之外，Western Blot 實驗在驗證蛋白降解方面更為直觀，因此常常被用于 PROTAC 類分子活性的測試。
圖8. 靶蛋白與 Western Blot 實驗結(jié)果[9]
總結(jié)
PROTAC 已經(jīng)衍生出一類 “POI 配體-Linker-降解系統(tǒng)導(dǎo)向物” 模式的分子，這類分子補(bǔ)足了 PROTAC 作為降解劑在某些蛋白與非蛋白分子降解上的不足，賦予了降解劑這一概念更多的可能性。除了分子自身作用機(jī)制帶來活性測試結(jié)果上與常規(guī)分子的差異，合適的降解途徑對活性的影響尤其巨大。 MCE 是全球前沿的科研化學(xué)品和生物活性化合物供應(yīng)商，可以為科學(xué)家提供 PROTAC 類相關(guān)產(chǎn)品，目前我們已有 PROTAC、AUTAC、ATTEC、分子膠以及它們的構(gòu)成模塊等各種產(chǎn)品在線。同時，我們還提供 PROTAC 類產(chǎn)品的一體化合成服務(wù)。
ATTEC
LC3-mHTT-IN-AN2 (Compound AN2) 是一種 mHTT-LC3 連接化合物，LC3-mHTT-IN-AN2 與突變型亨廷頓蛋白 (mHTT) 和 LC3B 相互作用，但不與 wtHTT 或無關(guān)的對照蛋白相互作用。LC3-mHTT-IN-AN2 以等位基因選擇性的方式降低了亨廷頓病 (HD) 小鼠神經(jīng)元中mHTT水平。
LC3-mHTT-IN-AN1 (Compound AN1) 是一種 mHTT-LC3 連接化合物，LC3-mHTT-IN-AN1 與突變型亨廷頓蛋白 (mHTT) 和 LC3B 相互作用，但不與 wtHTT 或無關(guān)的對照蛋白相互作用。LC3-mHTT-IN-AN1 以等位基因選擇性的方式降低了亨廷頓病 (HD) 小鼠神經(jīng)元中mHTT水平。
AUTAC
AUTAC1是一種 MetAP2 靶向自噬介導(dǎo)降解體 (AUTAC)。AUTACs 包含一個降解標(biāo)簽和一個彈頭確保靶向特異性。AUTAC1 包含一個 FBnG 和一個 Fumagillol 部分。Fumagillol 共價結(jié)合到 MetAP2 上。
AUTAC2 是一種 FKBP12 靶向自噬介導(dǎo)降解體 (AUTAC)。AUTAC2 包含一個 FBnG 和 SLF 部分，其中 SLF 與FKBP12 非共價結(jié)合。
Molecular Glues
Mezigdomide (CC-92480) 是一種 cereblon E3 泛素連接酶調(diào)節(jié)藥物 (CELMoD)，以分子膠的方式作用。Mezigdomide 與 cereblon 有較強(qiáng)的親和力，具有抗骨髓瘤活性。
Eragidomide (CC-90009) 是首創(chuàng)的 GSPT1 選擇性 cereblon (CRBN) E3 連接酶調(diào)節(jié)劑，以分子膠的方式作用。Eragidomide 通過 CRL4CRBN 選擇性靶向 GSPT1 進(jìn)行泛素化和蛋白酶體降解。
FPFT-2216 是一種“分子膠”化合物，可降解磷酸二酯酶 6D (PDE6D)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子 Ikaros (IKZF1)、Aiolos (IKZF3) 和酪蛋白激酶 1α (CK1α)。FPFT-2216 可用于癌癥和炎癥疾病的研究。
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。
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