近年來(lái)，紅外光譜和顯微成像技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展,尤其是在生命科學(xué)領(lǐng)域，得益于紅外光譜技術(shù)對(duì)于分子結(jié)構(gòu)的敏感性，其能夠在無(wú)任何標(biāo)記的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品成分的鑒定和分布解析，這對(duì)于不便于熒光標(biāo)記的一些生物樣品鑒別十分有利。然而目前大多數(shù)的紅外光譜空間分辨率受限于紅外光的衍射限，只有10-20 μm，且依賴于紅外光波波長(zhǎng)。另外多數(shù)紅外檢測(cè)設(shè)備對(duì)于生物樣品制樣過(guò)程也有著嚴(yán)格要求，如樣品切片厚度，細(xì)胞和組織尺寸，含水量，需要熒光染色等，這對(duì)于生命科學(xué)研究非常不利。
針對(duì)上述問(wèn)題，美國(guó)Photothermal Spectroscopy Corp公司經(jīng)多年潛心攻關(guān)，研發(fā)出非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)—mIRage，該設(shè)備憑借其的光學(xué)光熱紅外（O-PTIR, Optical Photothermal Infrared）技術(shù)克服了上述問(wèn)題，將紅外光譜的空間分辨率提升至亞微米（~500 nm）；無(wú)需制備薄片，直接測(cè)試較厚樣品，大地簡(jiǎn)化了制樣過(guò)程、提高測(cè)試效率；同時(shí)可實(shí)現(xiàn)無(wú)接觸式地快速簡(jiǎn)易測(cè)量，有效避免了傳統(tǒng)ATR模式下的散射像差和交叉污染。且該設(shè)備在反射模式下所得譜圖與透射模式下FTIR完全一致，還可以選配透射模式，十分適用于液體樣品和一些特殊混合樣品，大的擴(kuò)展了光熱紅外在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍(如圖1所示)。這項(xiàng)先進(jìn)技術(shù)讓mIRage有別于傳統(tǒng)的紅外測(cè)試設(shè)備，能夠?qū)ι茖W(xué)領(lǐng)域的常用樣本，諸如細(xì)胞爬片，病理組織切片，單細(xì)胞細(xì)菌等有良好的兼容性，并讓活細(xì)胞觀測(cè)成為可能。除此之外，mIRage還可與拉曼光譜進(jìn)行聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)同時(shí)同地相同分辨率的IR和Raman測(cè)試，且無(wú)熒光風(fēng)險(xiǎn)，能夠幫助研究者更快速全面的確定所分析生物樣品的化學(xué)組成信息。
圖1. O-PTIR光學(xué)光熱紅外顯微鏡，工作原理及鈣化乳腺組織的O-PTIR紅外成像圖
光學(xué)光熱紅外O-PTIR在生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的顯著優(yōu)勢(shì)：
1.亞微米的空間分辨率；
2.可直接獲取液體中活細(xì)胞的紅外成像；
3.靈敏度高，可直接觀測(cè)單細(xì)胞(如細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等)；
4.無(wú)米氏散射干擾，即使在細(xì)胞邊緣也不受影響；
5.高的光譜分辨率；
6.無(wú)需直接接觸即可測(cè)量軟組織的紅外光譜；
7.可實(shí)現(xiàn)紅外和拉曼同步測(cè)量；
8.可實(shí)現(xiàn)超過(guò)10 μm厚的樣品測(cè)試，直接置于載玻片上觀察分析；
9.可配置化的紅外光源；
典型案例分析：
1.感染瘧原蟲的紅細(xì)胞表征
瘧原蟲屬寄生蟲引起的瘧疾是威脅生命的主要疾病之一，而瘧原蟲引發(fā)的感染周期十分復(fù)雜，因此在細(xì)胞和分子水平觀察瘧原蟲的變化對(duì)于研究瘧原蟲的致病有著重要意義。Agnieszka M. Banas等人通過(guò)使用O-PTIR對(duì)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞在亞微米尺度的分子特征變化進(jìn)行了表征，結(jié)果顯示正常紅細(xì)胞的蛋白呈現(xiàn)環(huán)狀分布，而感染后的紅細(xì)胞蛋白質(zhì)則呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則分布。通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)FTIR與基于O-PTIR技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)，O-PTIR能夠提供更為詳細(xì)的圖像分辨率并且能夠測(cè)量紅細(xì)胞不同位置的光譜信息。而傳統(tǒng)FTIR受制于米氏散射限制，效果較差。
圖2. 對(duì)比FTIR與O-PTIR對(duì)紅細(xì)胞成像的結(jié)果：(a)紅細(xì)胞的白光圖；(b)圖a中紅色方塊放大的區(qū)域；(c,e)FTIR的蛋白/脂質(zhì)空間分布的紅外成像；(d,f)O-PTIR的蛋白/脂質(zhì)空間分布的紅外成像；(g)紅細(xì)胞的FTIR紅外光譜；(h)紅細(xì)胞的O-PTIR紅外光譜;(g,i)瘧原蟲感染紅細(xì)胞和正常紅細(xì)胞的PCA（PC1&PC2，PC1&PC3）得分；(h,j)瘧原蟲感染紅細(xì)胞和正常紅細(xì)胞的PCA（PC1&PC2，PC1&PC3）得分
參考文獻(xiàn)：
B. [Malaria] “Comparing infrared spectroscopic methods for the characterization of Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes” (Nature Communication Chemistry, https://doi.org/10.1038/s42004-021-00567-2). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
2.單個(gè)病毒的紅外成像
受制于紅外限分辨率的限制，單個(gè)病毒的紅外光譜成像一直以來(lái)都是十分困難的，對(duì)于只有100 nm左右的病毒進(jìn)行紅外光譜成像顯得十分無(wú)力。Yi Zhang等人使用O-PTIR技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)痘病毒進(jìn)行了檢測(cè)，并成功觀測(cè)到了病毒的外形，并對(duì)病毒表面的蛋白的光譜進(jìn)行了表征。
圖3.單個(gè)痘病毒的光譜和成像表征。(a)痘病毒的干涉散射圖像;(b)痘病毒1550cm-1波束下的MIP圖像;(c)痘病毒1650cm-1波束下的MIP圖像;(d)隨機(jī)選取病毒上4個(gè)點(diǎn)的光譜
參考文獻(xiàn)：
“Vibrational Spectroscopic Detection of a Single Virus by Mid-Infrared Photothermal Microscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
3. 光學(xué)光熱紅外O-PTIR與Raman光譜協(xié)同分析固定或活的單細(xì)胞
英國(guó)曼徹斯特大學(xué)的Peter Gardner教授近期發(fā)表了他們關(guān)于活(和固定)細(xì)胞振動(dòng)光譜分析的新研究結(jié)果。作者使用光學(xué)光熱紅外O-PTIR與Raman光譜，并借助于兩個(gè)激發(fā)源（QCL和OPO激光器），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了寬光譜范圍的覆蓋，從而使所有與生物學(xué)相關(guān)的分子振動(dòng)都能被檢測(cè)到，且保持一致的亞微米的空間分辨率。此外，紅外光譜采集與拉曼光譜有效的結(jié)合起來(lái)，在相同的激發(fā)位置，形成振動(dòng)互補(bǔ)，得到一套完整的振動(dòng)光譜信息。如下圖所示，該紅外和拉曼的組合方式可以用來(lái)分析液體環(huán)境中固定或活細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中的蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)及富脂體均可以在亞微米尺度上被有效地識(shí)別出來(lái)。
圖4. O-PTIR觀測(cè)固定未染色MIA PaCa-2細(xì)胞成像。(a)固定的未染色的MIA PaCa-2細(xì)胞的光學(xué)圖像；(b)紅色方塊區(qū)域的放大圖像；(c)OPO波束段的O-PTIR紅外光譜；(d)QCL波束段O-PTIR的紅外光譜；(e)黑色區(qū)域的拉曼和紅外光譜
參考文獻(xiàn)
D. [Mammalian cancer cell] “Analysis of Fixed and Live Single Cells Using Optical Photothermal Infrared with Concomitant Raman Spectroscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c04846). Advantages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
4. O-PTIR與S-XRF聯(lián)用探究阿爾茲海默癥
阿爾茲海默癥是老年癡呆癥常見(jiàn)的病因之一，而淀粉樣β蛋白沉淀是引發(fā)AD的重要病因之一，因此對(duì)于淀粉樣β蛋白分布的研究就顯得十分重要。Nadja Gustavsson等人通過(guò)O-PTIR成功觀測(cè)到了神經(jīng)中的淀粉樣β蛋白分布，并且結(jié)合S-XRF分析發(fā)現(xiàn)鐵簇與淀粉樣β-折疊結(jié)構(gòu)和氧化的脂質(zhì)存在共定位關(guān)系。這項(xiàng)研究充分預(yù)示了O-PTIR/S-XRF聯(lián)合技術(shù)可在AD疾病的研究中發(fā)揮重要作用。
圖5.單個(gè)神經(jīng)元的O-PTIR與X光熒光成像。（a）單個(gè)神經(jīng)元的光學(xué)（左）與O-PTIR圖像（中和右）（b）神經(jīng)元上銅、鐵的分布（c）鐵與蛋白疊合圖（d）鐵與脂質(zhì)的疊合圖
參考文獻(xiàn)
[Neuron] “Correlative optical photothermal infrared and X-ray fluorescence for chemical imaging of trace elements and relevant molecular structures directly in neurons” (“Light: Science & Applications” https://doi.org/10.1038/s41377-021-00590-x) Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
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相關(guān)產(chǎn)品：
1、非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)—mIRage
