線粒體狀態(tài)呼吸液相氧電極測定方法
文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100735
線粒體是細(xì)胞物質(zhì)代謝和能量代謝的樞紐，也是逆境脅迫的主要攻擊位點(diǎn)之一，在生物和非生物逆境脅迫條件下，細(xì)胞線粒體正常功能的維持對生物抵抗逆境能力的大小起至關(guān)重要的作用。在線粒體呼吸過程中，呼吸電子傳遞伴隨著跨線粒體膜質(zhì)子梯度的形成，ATP合酶利用這一跨膜質(zhì)子梯度合成ATP，在正常細(xì)胞中，線粒體的電子與質(zhì)子傳遞是與氧化磷酸化相偶聯(lián)的，因此ADP的供應(yīng)會(huì)影響到呼吸電子傳遞的速率。在通常情況下，呼吸電子傳遞的底物如琥珀酸、NADH是充足的，ADP的供應(yīng)往往作為限制因素，從而調(diào)節(jié)整個(gè)呼吸過程。
為了精確地研究這種基于ADP的呼吸控制，Chance和Williams（1956）根據(jù)呼吸底物以及ADP不同存在情況下的線粒體呼吸速率，提出呼吸狀態(tài)（又稱狀態(tài)呼吸，respiration state）的概念：
A.狀態(tài)I呼吸是指在沒有添加任何呼吸底物及ADP情況下線粒體的呼吸速率（內(nèi)源呼吸）；
B.加入ADP之后的呼吸速率稱為狀態(tài)II呼吸；
C.在呼吸底物和ADP都存在時(shí)的呼吸速率稱為狀態(tài)III呼吸（最大呼吸）；
D.ADP被消耗殆盡但呼吸底物仍然剩余時(shí)的呼吸速率稱為狀態(tài)IV呼吸（剩余呼吸）。
由于在完整的生物細(xì)胞內(nèi)，線粒體呼吸受到細(xì)胞內(nèi)其它物質(zhì)代謝以及能量代謝的影響，直接測定細(xì)胞的呼吸不能精確地反映線粒體的功能，因此建立一種能夠相對精確測定線粒體內(nèi)各種狀態(tài)呼吸的方法至關(guān)重要。
本文列出了改進(jìn)后的液相氧電極測定小鼠肌肉細(xì)胞線粒體的狀態(tài)呼吸過程的方法。主要內(nèi)容有氧氣消耗速率（OCR）、磷氧比（P/O）、呼吸控制率（RCR）和寡霉素敏感呼吸等測定方法。
測定步驟：
1. 配制所需試劑溶液（點(diǎn)擊“閱讀原文”查看詳細(xì)信息）
2. 安裝并校準(zhǔn)液相氧電極
3. 提取線粒體（點(diǎn)擊“閱讀原文”查看詳細(xì)信息）
圖1. 線粒體提取流程
4. 測定過程：線粒體氧氣消耗速率（OCR）及狀態(tài)呼吸
4.1 向反應(yīng)室中加入適量的呼吸緩沖液。
4.2 向反應(yīng)室中加入適量的線粒體。
4.3 蓋上反應(yīng)杯蓋。
4.4 點(diǎn)擊“Go”開始測定（此階段為狀態(tài)I）。
4.5 在約30s時(shí)加入呼吸底物（此階段為狀態(tài)IV）。
4.6 在約2min 30s時(shí)，使用注射器向反應(yīng)室中加入ADP（此階段為狀態(tài)III）。
圖2. 液相氧電極測定線粒體狀態(tài)呼吸流程
4.7 等待所有的ADP消耗，轉(zhuǎn)換為ATP，此時(shí)反應(yīng)室只有底物，反應(yīng)速率降低，斜率變緩（此階段為狀態(tài)IV）。
4.8 在約4min 30s時(shí)加入ADP。
4.9 在約5min 30s時(shí)加入寡霉素。
4.10 在約6min 30s時(shí)，加入FCCP（可獲得最大呼吸）。
4.11 在約7min 30s時(shí)，加入抗霉素A（終止呼吸）。
4.12 在約8min 30s時(shí)，停止測定并保存數(shù)據(jù)。
5. 預(yù)期結(jié)果
圖3. 健康組織線粒體不同底物狀態(tài)呼吸預(yù)期曲線
6. 數(shù)據(jù)獲取和計(jì)算
6.1 氧氣消耗速率（OxygenConsumption Rate，OCR）：根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)線粒體消耗氧氣量計(jì)算獲得的。氧電極軟件（OxyTrace+或者O2view）有斜率截取功能。
6.2 呼吸控制率（Respiration Control Index/Rate，RCI or RCR）：計(jì)算方式為狀態(tài)III/狀態(tài)IV（L），該值是耦合線粒體的控制指標(biāo)。
6.3 磷氧比（P/O，Phosphate/OxygenRatio）：根據(jù)狀態(tài)III反應(yīng)前后反應(yīng)室中的氧氣含量，可以計(jì)算出整個(gè)狀態(tài)III階段的耗氧總量（此時(shí)算出的是O2分子數(shù)目），最后將測定狀態(tài)III時(shí)加入ADP的量（分子數(shù)目）除以耗氧總量（換算成O原子數(shù)目）即得到被測線粒體的P/O。
6.4 寡霉素敏感呼吸（OSR）：將狀態(tài)III斜率與注射寡霉素后獲得的斜率進(jìn)行計(jì)算。該值代表H+-ATP合酶活性（注：H+-ATP合酶功能失調(diào)可能導(dǎo)致Δψm的改變）。
7. 注意事項(xiàng)
7.1 蓋上反應(yīng)杯蓋后所有試劑均應(yīng)使用注射器進(jìn)行添加。
7.2 需要留出足夠的時(shí)間計(jì)算加入試劑之后的斜率。上文所示添加試劑的時(shí)間并不是固定的，具體時(shí)間仍需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，建議提前準(zhǔn)備預(yù)實(shí)驗(yàn)。
7.3 建議同一處理至少進(jìn)行3次重復(fù)以保證其代表性。
7.4 低于初始氧濃度10%時(shí)可能出現(xiàn)呼吸限制，影響正常測定。確保在氧氣限制之前完成實(shí)驗(yàn)。
7.5 每次注射后，至少用乙醇和水仔細(xì)清潔注射器兩次。
7.6 上文中添加試劑的體積和濃度需根據(jù)具體待測對象確定，可參考文末相關(guān)文獻(xiàn)
7.7 溫度對氧電極影響較大，實(shí)驗(yàn)必須在恒溫下進(jìn)行。
7.8 底物和抑制劑易在反復(fù)凍融中降解，強(qiáng)烈建議使用新鮮制備的試劑。
8. 問題及解決方法
8.1 如何確保氧電極正常工作？
開始測定，單擊GO。等待信號線穩(wěn)定。如果信號線穩(wěn)定，則氧電極工作正常，如果信號線波動(dòng)較大，氧電極工作不正常。此時(shí)需拆卸電極，重新清潔電極，重新安裝校正。
8.2 如何檢查線粒體是否解耦聯(lián)？
通過向線粒體體系中添加外源細(xì)胞色素c（cyt c）進(jìn)行呼吸測定。如果線粒體在制備過程中受損或解偶聯(lián)，添加cyt c將增加氧通量，表示外膜的損傷和內(nèi)源cyt c的丟失。
8.3 線粒體未偶聯(lián)（低RCR）
可能是緩沖液配制錯(cuò)誤或儲(chǔ)存不當(dāng)。建議重新配制所有緩沖液。肥胖和衰老的動(dòng)物細(xì)胞，線粒體質(zhì)子泄漏增加，線粒體內(nèi)膜脂質(zhì)成分改變，RCR會(huì)偏低。確保對照組動(dòng)物年輕健康。
8.4 多次測定后線粒體對底物/抑制劑的反應(yīng)不正常
可能是氧電極反應(yīng)室中存在微量抑制劑或雜質(zhì)（清潔不徹底）。此時(shí)需用超純水、乙醇和超純水徹底清潔反應(yīng)室。也可向反應(yīng)室內(nèi)添加PBS+1%BSA，以增強(qiáng)清潔效果。增加洗滌時(shí)間也有助于去除抑制劑。
8.5 電極不靈敏（斜率緩慢，信號線不穩(wěn)定）
檢查反應(yīng)室中是否存在氣泡。如果有氣泡，可使用吸管反復(fù)輕微吸打溶液。檢查鉑極附近是否有氣泡，如果有，需拆卸重新安裝電極?；蛘哌m當(dāng)增加反應(yīng)室中線粒體蛋白的濃度。
9. 相關(guān)閱讀
9.1 液相氧電極基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指南
9.2 單線態(tài)氧對大鼠腦細(xì)胞線粒體能量代謝的影響
9.3 積雪草酸通過線粒體定向防護(hù)機(jī)制改善大鼠肝臟缺血再灌注損傷
10. 相關(guān)文獻(xiàn)
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