ELISA技術(shù)應(yīng)用概覽和方法學(xué)開發(fā)初析
簡簡介介
本文適用于已有過ELISA應(yīng)用相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，對ELISA問題排查和方法開發(fā)有進(jìn)一步需求的廣大科研人員，更加適用于ELISA相關(guān)醫(yī)療診斷試劑盒開發(fā)，體內(nèi)藥代藥動相關(guān)大分子檢測，抗體結(jié)合活性質(zhì)控等在合規(guī)方面有方法學(xué)驗(yàn)證要求的藥物研發(fā)工業(yè)領(lǐng)域從業(yè)者。ELISA檢測技術(shù)的間接性，應(yīng)用領(lǐng)域的廣泛性，樣品來源的復(fù)雜性和試劑各成分反應(yīng)過程的可逆性導(dǎo)致ELISA的方法開發(fā)和實(shí)際的使用過程中會出現(xiàn)各種異常情況，本文的目的是區(qū)分ELISA的使用目的，明確目的相關(guān)ELISA方法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分步解析ELISA間接檢測的信號傳遞過程以及傳遞偏差對檢測方法的影響，簡略探討免疫反應(yīng)（配體-受體結(jié)合）的化學(xué)本質(zhì)和數(shù)學(xué)原理，并重新評估棋盤法在ELISA方法開發(fā)的指導(dǎo)意義，倡導(dǎo)以使用目的為導(dǎo)向通過方法學(xué)驗(yàn)證為目標(biāo)的ELISA方法學(xué)開發(fā)。
ELISA應(yīng)用
ELISA檢測技術(shù)早在19世紀(jì)70，80年代就開發(fā)出來用于替代放射性同位素標(biāo)記技術(shù)用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用（配體-受體，抗原-抗體），到如今已經(jīng)接近50年的歷史了。這個技術(shù)從科研的角度來說已經(jīng)不具備第一性，沒有太多的價值，不值得專門進(jìn)行研究，更多的是一個使用的工具。工業(yè)應(yīng)用落后于基礎(chǔ)研究，ELISA技術(shù)在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用隨著近20年生物制藥領(lǐng)域的迅猛發(fā)展展現(xiàn)著越來越多的使用價值，當(dāng)然ELISA的應(yīng)用情況也越來越復(fù)雜，這樣的復(fù)雜性也使得早期的基礎(chǔ)研究并不再具有很好的指導(dǎo)意義，ELISA方法濫用錯用往往導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，做出錯誤的選擇。本文的寫作目的旨在作為文獻(xiàn)之外關(guān)于ELISA實(shí)際應(yīng)用的一個總結(jié)，反補(bǔ)基礎(chǔ)研究的不足，使得該技術(shù)更具使用價值。
從早期抗體發(fā)現(xiàn)階段，雜交瘤的滴度測定，噬菌體展示的淘選篩選；抗體的穩(wěn)轉(zhuǎn)，瞬轉(zhuǎn)和發(fā)酵過程的表達(dá)量監(jiān)控，體外抗體和對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白或細(xì)胞表面受體的親和力評價，細(xì)胞因子的監(jiān)控，體內(nèi)抗體藥物的藥代動力學(xué)，藥效生物標(biāo)志物的含量檢測和免疫原性測定等均會使用ELISA技術(shù)。ELISA技術(shù)可以說是一個通用的，入門十分簡單，應(yīng)用面十分廣泛，高通量的技術(shù)。小木蟲，丁香園等關(guān)于ELISA的問題經(jīng)久不衰，ELISA技術(shù)由于其檢測的間接性（信號進(jìn)行了多重傳遞），使用目的的差異性和樣品來源的復(fù)雜性導(dǎo)致ELISA方法一旦出現(xiàn)異常實(shí)驗(yàn)地操作者很多時候很難進(jìn)行問題排除。小編有過多年的ELISA相關(guān)應(yīng)用方法學(xué)的開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行了多個ELISA應(yīng)用的開發(fā)和方法學(xué)驗(yàn)證，從一個ELISA方法開發(fā)和ELISA平臺技術(shù)搭建者的角度，對ELISA方法應(yīng)用進(jìn)行梳理和系統(tǒng)分析。
使用目的
從使用目的來說，ELISA方法可以分為兩類。第一類：生物大分子的定量，第二類：親和力測定評價或者篩選?？贵w的穩(wěn)轉(zhuǎn)、瞬和發(fā)酵過程的表達(dá)量監(jiān)控，細(xì)胞因子的監(jiān)控，體內(nèi)抗體藥物的藥代動力學(xué)，藥效生物標(biāo)志物的含量檢測和免疫原性測定等可劃分為第一類使用目的，雜交瘤的滴度測定，噬菌體展示的淘選篩選，體外抗體和對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白或細(xì)胞表面受體的親和力評價可劃分為第二類使用目的。使用目的不一樣，即使使用同樣的試劑材料，也會有不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ胶蛿M合曲線。下面小編將以某抗體的定量的方法開發(fā)（第一類目的）和親和力檢測方法開發(fā)（第二類目的）為例，對不同使用目的開發(fā)策略進(jìn)行介紹。
該方法的檢測體系如下，靶點(diǎn)蛋白（抗原）包被，樣品（人抗體）進(jìn)行反應(yīng)，酶聯(lián)二抗為羊抗人HRP偶聯(lián)多抗，顯色液為TMB顯色液。使用目的是對樣品進(jìn)行定量和親和力分析。
如表一，表二，采用相同的試劑材料，不同的試劑相對濃度得到了如圖1不一樣的劑量曲線來滿足不同的使用目的。而兩個方法最核心的不同在于包被抗原的量相對于梯度稀釋樣品的量，如果一個ELISA需要達(dá)到精密，準(zhǔn)確等驗(yàn)證需求，在定量方法的開發(fā)過程中包被抗原的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)品（樣品）的量，這樣樣品能夠抵消抗原抗體可逆反應(yīng)的影響，使得近似所有的抗體樣品均被捕捉到，標(biāo)準(zhǔn)曲線如果做對數(shù)線性擬合能夠得到非常好的線性。在親和力評價中，這跟同位素標(biāo)記測配體受體的親和力的原理一致，包被少量的包被抗原，采用飽和浸潤法即包被抗原的量相對于樣品的量是由遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于抗原的量到遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗原的量的過程，需要有完整的上下漸進(jìn)線，S型曲線，其EC50即親和力數(shù)值（解離平衡常數(shù)）。兩個使用目的采取的實(shí)驗(yàn)條件涉及到抗原抗體可逆反應(yīng)化學(xué)原理的數(shù)學(xué)推導(dǎo)，鑒于多寫一個數(shù)學(xué)公式可能會使讀者少上不少，公式推導(dǎo)已做省略，不同使用目的的假設(shè)推導(dǎo)過程也給出，有志于深耕ELISA領(lǐng)域的讀者可以好好研究下。
采用相同的實(shí)驗(yàn)材料，不同的試劑配比以分別達(dá)到生物大分子定量和親和力評價的使用目的并進(jìn)行對比的研究，至目前為止，小編并未在任何文獻(xiàn)上見到過類似的研究，但是在實(shí)際的應(yīng)用過程中達(dá)到了很好的效果，這也是小編想把這篇文章寫下來，期望借助互聯(lián)網(wǎng)的力量把這個不具有很大的科學(xué)價值但是有很廣泛的使用價值的技術(shù)進(jìn)行傳播討論，達(dá)到越辯越明的目的。
ELISA方法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)
當(dāng)然，從一個藥物研發(fā)從業(yè)者的角度來看，開發(fā)出來的方法需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，符合相關(guān)法律法規(guī)后才能夠確認(rèn)成功，這是從質(zhì)量分析控制的尺度去對一個ELISA方法進(jìn)行評估，可以說是最為嚴(yán)格的評估方式。這個工作可能主要集中在質(zhì)量控制相關(guān)的部門，涉及到一個檢驗(yàn)方法好壞的評價標(biāo)準(zhǔn)，小編正好也負(fù)責(zé)過幾個ELISA方法的驗(yàn)證工作，簡單介紹下，涉及到相關(guān)的法律法規(guī)，具體實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和程序以法規(guī)為準(zhǔn)。
生物大分子定量方法學(xué)驗(yàn)證
ELISA方法的第一類使用目的是生物大分子定量，這個可以參考2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。里面有比較細(xì)致關(guān)于生物大分子定量方法的準(zhǔn)確度，精密度，線性和范圍，耐用性等方面的驗(yàn)證要求。在小編看來，在ELISA 定量開發(fā)出來后如果初步判斷一個檢測方法能否通過驗(yàn)證，主要看兩點(diǎn)，第一點(diǎn)是標(biāo)準(zhǔn)品的曲線擬合后的回測偏差是否在比較合適和穩(wěn)定范圍內(nèi)（最佳±10%），第二就要看標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品在檢測體系中是否具有相同的免疫學(xué)特性（平行性）。這個可以通過梯度稀釋樣品信號代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)稀釋倍數(shù)校正后測定的濃度值在各稀釋倍數(shù)是否吻合來判斷。相同的免疫學(xué)特性是一個非常重要的概念，也是一個方法開發(fā)是否成功的關(guān)鍵。免疫學(xué)特性不僅僅指的待測樣品和包被抗原的親和力特性，也包含待測樣品和酶聯(lián)抗體的親和力特性。即使是同樣的物質(zhì)，當(dāng)樣品經(jīng)過體內(nèi)代謝循環(huán)后其免疫學(xué)特性有可能發(fā)生改變，那么未經(jīng)體內(nèi)代謝的對照品是否能夠作為標(biāo)準(zhǔn)品需要經(jīng)過平行性驗(yàn)證。即使不同的物質(zhì)，只要有相同的免疫學(xué)特性，也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定量，小編就搭建了雙抗Fc方法(包被為抗Fc抗體，酶聯(lián)抗體也為抗Fc抗體-HRP)作為通用方法，IGg作為對照品進(jìn)行多個抗體和融合蛋白的常規(guī)檢測，經(jīng)過分子量校準(zhǔn)后的檢測結(jié)果和純化后紫外的檢測結(jié)果有可比性。
親和力測定驗(yàn)證（相對結(jié)合活性方法學(xué)驗(yàn)證）
親和力指得是抗體和靶點(diǎn)抗原的解離平衡常數(shù)，是一個非常重要的生物特性。在質(zhì)量控制過程中，常用ELISA方法進(jìn)行不同批次或者長期穩(wěn)定性樣品的親和力評價。親和力一般來說是絕對值，但是由于生物實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，材料批次的替換可能會影響到樣品的親和力檢測準(zhǔn)確性，常會引入一個默認(rèn)質(zhì)量屬性不會變化的對照品作為參比品，待測樣品和參比品一同進(jìn)行檢測來抵消材料造成的偏差，并計(jì)算待測樣品相對于參比品的親和力（相對結(jié)合活性）
生物功能學(xué)方法的評價中國藥典目前沒有詳細(xì)的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，只有宏觀的分析方法準(zhǔn)確度，精密度，線性和范圍，耐用性等要求，F(xiàn)DA在USP1032,USP1033,USP1034有比較詳細(xì)和完整的生物功能學(xué)方法驗(yàn)證方案設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的案例，可以用來評價ELISA建立的親和力評價方法的質(zhì)量。
系統(tǒng)分析：信號進(jìn)行了多重傳遞和傳遞過程可能出現(xiàn)的偏差
ELISA是一個間接的檢測過程，這在很多文獻(xiàn)資料上都有這樣的記載。但是很少有研究資料詳細(xì)的描述間接測量的信號傳遞過程，以及傳遞過程中出現(xiàn)的偏差。這里小編從宏觀和微觀兩個角度對ELISA進(jìn)行系統(tǒng)分析，該分析有助于搭建穩(wěn)定的ELISA平臺，并正確地使用和評估不同性質(zhì)的酶聯(lián)抗體和顯色液等通用材料。
如圖2所示，宏觀上來講，ELISA檢測的函數(shù)曲線在實(shí)際操作過程中描述的是劑量濃度的抗體和信號之間的相關(guān)關(guān)系，而其實(shí)質(zhì)是為了描述劑量濃度的抗體和對應(yīng)抗原-抗體偶聯(lián)物之間的相關(guān)關(guān)系。抗原-抗體偶聯(lián)物經(jīng)過了酶聯(lián)抗體反應(yīng)和酶催化放大反應(yīng)，催化產(chǎn)物檢測后轉(zhuǎn)換成信號。該信號間接的代表了抗原-抗體偶聯(lián)物。這種間接的轉(zhuǎn)化過程經(jīng)歷了三重信號的傳遞過程，而只有在三重傳遞保證線性的情況，抗體濃度-信號劑量曲線才能等同于抗體濃度-抗體抗原偶聯(lián)物濃度劑量曲線，如果進(jìn)行了非線性傳遞將會影響到整個檢測方法的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，下面小編將從微觀角度簡單介紹下信號傳遞過程中可能存在的偏差。
1.信號檢測偏差：酶催化產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成信號時有可能會產(chǎn)生的偏差，這個偏差在一些文獻(xiàn)中也稱之為儀器的非線性檢測區(qū)域，即當(dāng)酶催化產(chǎn)物濃度過高時，催化產(chǎn)物濃度和信號值之間不完全呈線性關(guān)系，這個現(xiàn)象是普遍存在的，如圖3所示某品牌酶標(biāo)儀的參數(shù)性能，注意該儀器的測量范圍是0-4 OD，而該儀器確保的檢測線性范圍是0-3 OD。一般來講在進(jìn)行吸光度法讀數(shù)時，檢測的信號值最高值控制在3左右。如果兩個相鄰的抗體濃度點(diǎn)對應(yīng)的信號值在OD值3.5及以上時都會特別接近，這兩個信號值很有可能是有信號傳遞偏差的。這個可以通過高濃度的酶催化產(chǎn)物梯度稀釋查看信號的線性范圍確認(rèn)。
2.酶催化反應(yīng)傳遞偏差：該偏差是由酶催化顯色液引起的，其實(shí)質(zhì)是酶聯(lián)抗體的濃度和其對應(yīng)催化產(chǎn)物的濃度是否線性相關(guān)。如圖4所示由于酶催化反應(yīng)在未終止前是一個持續(xù)反應(yīng)的信號放大過程，信號的產(chǎn)生是時間的累積量，在反應(yīng)過程中酶活可能會喪失（左），顯色液的有效成分在不斷的減少時，梯度濃度的酶催化反應(yīng)在反應(yīng)時間內(nèi)的可能不會是勻速反應(yīng)狀態(tài)（右）。
這個可以通過動力學(xué)讀數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。目前市面上有多種顯色液可供選擇，顯色能力最強(qiáng)和最弱的產(chǎn)品信號差異可能達(dá)到20-50倍，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的正確的選擇顯色液并確認(rèn)酶催化過程的線性傳遞。
3.酶聯(lián)抗體反應(yīng)傳遞偏差，即酶聯(lián)抗體和抗體抗原偶聯(lián)物反應(yīng)后，酶聯(lián)抗體-抗原抗體偶聯(lián)物的濃度能否線性的代表抗體抗原偶聯(lián)物的濃度。這個比較復(fù)雜的過程，主要是因?yàn)槊嘎?lián)抗體的異質(zhì)性導(dǎo)致的，酶聯(lián)抗體多為多抗，該抗體偶聯(lián)上的HRP分子數(shù)目也存在差異，很難用單一的實(shí)驗(yàn)去論證這個線性過程。但值得注意的是，酶聯(lián)抗體加入反應(yīng)濃度應(yīng)該遠(yuǎn)大于抗體抗原偶聯(lián)物的濃度，這樣能夠保證基本所有的抗體抗原偶聯(lián)物都被轉(zhuǎn)換成酶聯(lián)抗體-抗原抗體偶聯(lián)物，酶聯(lián)濃度加入過少會導(dǎo)致劑量曲線的高濃度點(diǎn)出現(xiàn)假平臺期，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；酶聯(lián)濃度過高可能會導(dǎo)致非特異信號的增加，還有酶聯(lián)濃度的增加會導(dǎo)致信號的增加，可能會導(dǎo)致信號值超過線性檢測范圍。所以酶聯(lián)濃度的反應(yīng)濃度是一個值得選擇的參數(shù)。
免疫反應(yīng)（配體-受體結(jié)合）的化學(xué)本質(zhì)和數(shù)學(xué)原理解析
如果一個ELISA實(shí)驗(yàn)間接的檢測過程保證信號的線性傳遞，我們就可以研究下抗體和抗原這樣一個可逆反應(yīng)的過程，以及其化學(xué)原理，數(shù)學(xué)原理和假設(shè)。
假設(shè)我們考慮的是不涉及多步反應(yīng)的簡單的可逆反應(yīng)的過程。即Ag和Ab反應(yīng)生成二元復(fù)合物Ab·Ag，Ag，Ab，Ab·Ag之間地可逆反應(yīng)，正反應(yīng)是二級反應(yīng)，其反應(yīng)速率常數(shù)為Kon，逆反應(yīng)為一級反應(yīng)，即逆反應(yīng)速率常數(shù)為Koff，即：
Ab:包被的酶標(biāo)板條上的固定抗體 Ag：分析物
[Ab]:包被在酶標(biāo)板條上的固定抗體的含量
[Ag]:待檢測的分析物的含量
[Ab·Ag]: Ag和Ab反應(yīng)后形成的偶聯(lián)物的含量
[Ag]f:反應(yīng)進(jìn)程中，尚未和Ab結(jié)合的自由地Ag的含量
[Ab]f:反應(yīng)進(jìn)程中，尚未和Ag結(jié)合的自由地Ab的含量
Kd= KoffKon 1.0
Ab·Ag的生成速度可表示為公式1.1
d[Ab·Ag]dt = Kon[Ag]f[Ab]f 1.1
Ab·Ag的解離速度可表示為公式1.2
-d[Ab·Ag]dt = Koff[Ab·Ag] 1.2
由1.0-1.2可以進(jìn)行簡單的數(shù)學(xué)推導(dǎo)得到下面兩個公式（推導(dǎo)過程略）
即：
[Ab·Ag] =Ag [Ab]fKd+ [Ab]f 1.8.1
或[Ab·Ag] =Ab [Ag]fKd+ [Ag]f 1.8.2
假設(shè)：[Ab]? [Ag]，則[Ab]?[Ab·Ag]，則 [Ab]f= [Ab] - [Ab·Ag]≈[Ab]，1.8.1可轉(zhuǎn)換成
[Ab·Ag]=Ag [Ab]Kd+ [Ab] =[Ag]KdAb+1 1.9
當(dāng)[Ab·Ag]=1/2 [Ag] 時，Kd=[Ab] 1.10
假設(shè)：[Ag]? [Ab]，則[Ag]?[Ab·Ag]，則 [Ag]f= [Ag] - [Ag·Ab]≈[Ag]，
1.8.2可轉(zhuǎn)換成
[Ab·Ag]=Ab [Ag]Kd+ [Ag] =[Ab]KdAg+1 1.11
如果：[Ag]? Kd 則Kd/[Ag]≈ 0 , 公式1.11可轉(zhuǎn)換為
[Ab·Ag]≈[Ab]， 1.12
即檢測到的[Ab·Ag]的量約等于[Ab]的量
兩邊取log以消除不同濃度點(diǎn)的方差差異得
Log[Ab·Ag]≈Log [Ab] 1.13
[Ab·Ab]只有經(jīng)過酶聯(lián)抗體反應(yīng)和酶催化反應(yīng)的線性放大后才能得到
Log(OD)=a Log [Ab] + b 1.14
這樣一個數(shù)學(xué)推導(dǎo)過程并不困難，如果短時間內(nèi)不能理解可以看后續(xù)的討論
兩個假設(shè)具有十分重要的指導(dǎo)意義在于：
如為得到1.9的公式所做的假設(shè)，公式1.8.1只有當(dāng)包被的抗原的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于加入反應(yīng)的抗體的濃度時，劑量曲線的EC50的抗體濃度值才能代表抗體抗原間的親和力常數(shù)Kd。這個即ELISA親和力檢測方法模型，經(jīng)歷了一重假設(shè)。該假設(shè)是包被的抗原的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少量。
為得到1.14的公式，所做的假設(shè)，公式1.8.2只有當(dāng)包被的抗原的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于加入反應(yīng)的抗體的濃度時，且包被的抗原的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Kd值時劑量曲線的才能進(jìn)行對數(shù)擬合（文章之初用四參數(shù)擬合代替對數(shù)擬合是另一個故事，有機(jī)會再講）。這個即ELISA定量檢測方法模型，經(jīng)歷了二重假設(shè)。該假設(shè)分別是包被的抗原的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于反應(yīng)抗體的濃度，包被的抗原的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Kd（親和力，解離平衡常數(shù)），在這兩個假設(shè)中包被的抗原的濃度都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量，抗體和抗原的Kd要越小(強(qiáng)親和力)。
ELISA方法開發(fā)之棋盤法
小編在上文中初步區(qū)分ELISA的使用目的，明確目的相關(guān)ELISA方法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分步解析ELISA間接檢測的信號傳遞過程以及傳遞偏差對檢測方法的影響，探討免疫反應(yīng)（配體-受體結(jié)合）的化學(xué)本質(zhì)和數(shù)學(xué)原理解析，現(xiàn)在我們來看看文獻(xiàn)資料對ELISA方法開發(fā)的指導(dǎo)，截止目前為止小編看到的對于ELISA方法開發(fā)的指導(dǎo)均是經(jīng)典的教科書式的棋盤法。
如表三所示，棋盤滴定法即將包被抗原和酶聯(lián)抗體分為作橫縱系列稀釋，待檢測樣品（對照品）加入高，低和零濃度進(jìn)行反應(yīng)，在一塊96孔板中進(jìn)行多個條件的排列組合，通過檢測的信號值即零樣品組的背景信號值小于0.1，低濃度組有和背景信號區(qū)分的信號值，高濃度組的信號值和背景信號有比較大的信噪比來選擇合適的條件。
在實(shí)際的操作過程中，根據(jù)這樣的標(biāo)準(zhǔn)能夠選出多個符合標(biāo)準(zhǔn)的條件組合（黃色區(qū)域和藍(lán)色區(qū)域），這樣的方法在ELISA方法開發(fā)的初期并未起到很好的指導(dǎo)意義。選擇其中的一個條件組合繼續(xù)走下去進(jìn)行方法的開發(fā)可能最終通不過方法學(xué)驗(yàn)證，然后重新進(jìn)行另一個條件組合的嘗試和方法學(xué)驗(yàn)證，是一個十分低效的過程。
ELISA方法開發(fā)之初析
如何進(jìn)行高效地進(jìn)行一個方法學(xué)開發(fā)？
首先小編認(rèn)為我們需要明確ELISA方法開發(fā)的目的，如之前的化學(xué)原理分析和數(shù)學(xué)推導(dǎo)，如果是進(jìn)行大分子定量，包被的抗原遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量是方法穩(wěn)定的必然選擇；如果是進(jìn)行ELISA的親和力分析，包被的抗原少量是方法穩(wěn)定的必然選擇。這樣也就減少了一個變量，排除了大部分的可能。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，96孔板一個孔的抗原載量是有限的，如果是進(jìn)行定量方法的開發(fā)，包被的抗原濃度為5μg/ml，100μl足以過量，而進(jìn)行親和力方法開發(fā)，常用的包被的抗原濃度為100ng/ml，100μl或者200ng/ml，100μl.
其次要做好平臺的搭建工作，確認(rèn)通用的顯色液和酶聯(lián)抗體等試劑在信號傳遞過程中是否有可能存在偏差，即信號檢測偏差，酶催化反應(yīng)偏差和酶聯(lián)反應(yīng)偏差。
第三是熟悉不同使用目的的ELISA方法的方法學(xué)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。在方法學(xué)開發(fā)的初期就是以通過驗(yàn)證為最終目標(biāo)進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)。
展望
以上只是一個簡而概之的進(jìn)行ELISA方法開發(fā)的描述，作為一門實(shí)驗(yàn)技術(shù)還需要在正式的實(shí)驗(yàn)操作中去體會，很多不同廠商來源的酶標(biāo)板材，酶聯(lián)抗體和顯色液，樣品的復(fù)雜程度等均會影響到實(shí)驗(yàn)的效果，需要實(shí)驗(yàn)人員去了解各試劑耗材的物性，駕馭好信號值的大小變化。一個好的實(shí)驗(yàn)?zāi)０鍟僮吆芏鄰澛?，?jié)省很多不必要的花費(fèi)，小編能夠保證的是文章開篇的定量方法開發(fā)和親和力方法開發(fā)的實(shí)例是一個比較好的模板以供參考。需要說明的是本文描述的均是非競爭法條件下進(jìn)行ELISA方法學(xué)開發(fā)，競爭ELISA法進(jìn)行定量和親和力檢測有更加復(fù)雜的機(jī)理和更多的變量條件需要確認(rèn)，這是另一個故事。
ELISA是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的技術(shù)，其整個方法過程中經(jīng)歷了多重的信號傳導(dǎo)，間接的檢測過程使得該方法在實(shí)際使用過程中充滿了迷霧，一個宏觀全局的把控認(rèn)知和微觀細(xì)微的分步實(shí)驗(yàn)分析是搭建好一個可以進(jìn)行多方面應(yīng)用ELISA平臺的關(guān)鍵。在小編看來ELISA實(shí)驗(yàn)方法不是“一千個人眼中有一千個哈姆雷特”，而是”所有幸福的家庭是相似的;每個不幸的家庭各有各的不幸”。
