這個(gè)坑，別栽了！如何應(yīng)對(duì)ELISA基質(zhì)效應(yīng)？
2001年6月,美國(guó)曾爆出過一個(gè)大新聞：因?yàn)榕R床診斷中，hCG 免疫檢測(cè)試劑盒得到了假陽性結(jié)果，使一位名叫Jennifer Rufer的女性被誤診為癌癥，因此經(jīng)歷了長(zhǎng)期化療、肺部手術(shù)、甚至子宮切除。當(dāng)事人把醫(yī)院和診斷試劑公司告上法庭，獲得了1620萬美元的賠償，創(chuàng)下當(dāng)時(shí)醫(yī)療事故的最高賠償金額。
勝訴后的Jennifer Rufer
痛苦的遭遇，巨額的賠償，就因一個(gè)hCG檢測(cè)假陽性結(jié)果而起，這太坑了！法院把責(zé)任判給了診斷試劑公司和醫(yī)院，但這事的始作俑者其實(shí)是一種被稱為“基質(zhì)效應(yīng)”的免疫檢測(cè)干擾現(xiàn)象。
基質(zhì)效應(yīng)
基質(zhì)是指樣品中目標(biāo)分析物以外的部分，由于基質(zhì)成分會(huì)對(duì)分析過程有顯著干擾，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。業(yè)內(nèi)把這些影響統(tǒng)稱為基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effects）。這是免疫檢測(cè)方法開發(fā)和使用中需要避開的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一個(gè)典型的基質(zhì)效應(yīng)造成假陽性的案例。該hCG試劑盒用的抗體是鼠源的，業(yè)界觀點(diǎn)認(rèn)為部分人群血液含有抗鼠抗體（HAMA），它們對(duì)鼠源的捕獲抗體和檢測(cè)抗體都有高親和力，會(huì)造成基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致了假陽性。
如何評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)
基質(zhì)效應(yīng)的原因錯(cuò)綜復(fù)雜，但不用擔(dān)心，有兩種簡(jiǎn)單的方法可以用來評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)。
1. 線性稀釋：
一般來講，抗原和捕獲/檢測(cè)抗體之間的結(jié)合作用很強(qiáng)，樣品濃度被稀釋并不影響它們的結(jié)合，而造成基質(zhì)效應(yīng)的非特異結(jié)合的力要弱很多，如果不斷稀釋樣品，非特異結(jié)合造成的干擾會(huì)逐步減少，測(cè)量值也更接近真實(shí)值。沒有基質(zhì)效應(yīng)時(shí)，無論如何稀釋，測(cè)量值都和真實(shí)值吻合。而有基質(zhì)效應(yīng)時(shí)，稀釋會(huì)造成非特異性結(jié)合比例的減少，測(cè)量值也相應(yīng)地產(chǎn)生很大改變：
前文提到，基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果有假陰性和假陽性兩種，在線性稀釋時(shí)就可以辨別出來。下圖是兩組實(shí)測(cè)的ELISA產(chǎn)品線性稀釋的對(duì)比結(jié)果，不同品牌的ELISA 試劑盒表現(xiàn)差距非常大：
圖中的縱坐標(biāo)代表的是回收率。定義用原液直接檢測(cè)的值為100%，不同稀釋比下的測(cè)量值先乘上稀釋比換算出濃度，再除以原液直接檢測(cè)的值，比值的百分?jǐn)?shù)，就是回收率。
左圖的黃色線，和右圖的紅色線，曲線平直，回收率穩(wěn)定在90-110%，很好地控制了基質(zhì)效應(yīng)的干擾。左圖的紫色線，回收率隨線性稀釋嚴(yán)重偏離100%，說明存在顯著的基質(zhì)效應(yīng)；而回收率升高的趨勢(shì)，說明稀釋前的真實(shí)濃度被壓低，對(duì)應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)是假陰性。右圖的綠色線也嚴(yán)重偏離100%，但回收率隨稀釋降低，于左圖紫色線正好相反，屬于明顯的假陽性基質(zhì)效應(yīng)。
2. 摻入/回收率實(shí)驗(yàn)（Spike/Recovery Assay）
基質(zhì)效應(yīng)還可以通過分析物的摻入/回收率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將低、中和高濃度的分析物摻入到已測(cè)定過濃度的樣本中，摻入前后實(shí)測(cè)到的濃度增加部分與摻入濃度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈現(xiàn)。回收率介于80-120%，才符合標(biāo)準(zhǔn)。
R&D Systems 讓您免受基質(zhì)效應(yīng)折磨
基質(zhì)效應(yīng)可以通過產(chǎn)品研發(fā)階段的優(yōu)化盡可能去消除的。在ELISA試劑盒領(lǐng)域，R&D Systems是行業(yè)金標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品是高品質(zhì)的代名詞，其中一個(gè)質(zhì)量控制指標(biāo)就是針對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)品優(yōu)化:
1. 量身定制的緩沖液系統(tǒng)
優(yōu)化緩沖液是消除基質(zhì)效應(yīng)的重要一環(huán)，R&D Systems進(jìn)行ELISA試劑盒研發(fā)時(shí)，資深專家們會(huì)根據(jù)產(chǎn)品類型進(jìn)行系統(tǒng)的緩沖液優(yōu)化，為每種分析物量身定制最佳的緩沖液組合：
Quantikine ELISA Kit包含多種緩沖液，主要是Assay Diluent和Calibrator Diluent兩種稀釋液，對(duì)于差異較大的樣本，如細(xì)胞上清對(duì)比血清/血漿，會(huì)有專門的稀釋液分別對(duì)應(yīng)。這些優(yōu)化后的緩沖液體系能很好消除基質(zhì)效應(yīng)。
2. 排除交叉反應(yīng)
當(dāng)檢測(cè)某個(gè)分析物時(shí)，其他相關(guān)因子或類似結(jié)構(gòu)因子如果有非特異性結(jié)合，也會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)。為此，R&D Systems在Quantikine ELISA Kit研發(fā)時(shí)會(huì)進(jìn)行詳盡的交叉反應(yīng)測(cè)試：用相關(guān)因子單獨(dú)測(cè)試有無非特異性結(jié)合，將相關(guān)因子和分析物同時(shí)測(cè)試看是否存在干擾。
R&D Systems進(jìn)行大量?jī)?yōu)化，確保沒有明顯的交叉反應(yīng)和干擾，通過驗(yàn)證的相關(guān)因子都記錄在Quantikine ELISA Kit的說明書中，供您參考：
3. 嚴(yán)格的基質(zhì)效應(yīng)測(cè)試
R&DSystems 生產(chǎn)的所有Quantikine ELISA Kit，都必須通過嚴(yán)格的基質(zhì)效應(yīng)測(cè)試，包括線性稀釋和摻入/回收率實(shí)驗(yàn)，并把測(cè)試結(jié)果記錄在說明書中：
