DNA又稱基因工程(Genetic Engineering)。這項技術(shù)是在體外按照一定的目的和方案對DNA 分子進行人工操作，將同一來源或異源的基因進行重組，然后把它們引入適當(dāng)受體細胞中，隨著該細胞的繁殖，DNA 重組體得到擴增，并同時得到表達。這樣就可以獲得大量重組DNA 的產(chǎn)物。重組DNA 技術(shù)又稱為分子克隆(MolecularCloning)?？寺∫辉~原意為一個個體經(jīng)無性繁殖得到后代的總和。而分子克隆是將單一基因引入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞中，使其進行復(fù)制，從而得到重組DNA的大量拷貝。
(一)重組DNA常用的工具酶
將 DNA 在體外切割成小片段，然后再進行重組，這需要一系列酶的參加。這些酶稱為工具酶。常用的工具酶有以下幾種。
l.限制性內(nèi)切酶(Restriction Endonuclease ) 能識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特異核苷酸序列的酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的，其天然生物學(xué)功能是構(gòu)成細菌抵抗外源入侵DNA 的防御機制。限制性核酸內(nèi)切酶常分為三種類型： I型限制性核酸內(nèi)切酶對DNA鏈的識別位點與切割位點不同，不能產(chǎn)生特異性DNA 片段;II 型限制性核酸內(nèi)切酶能識別與切割DNA 鏈上同一個特異性核苷酸序列，產(chǎn)生特異性的DNA片段;III型限制性核酸內(nèi)切酶雖有特異性切割位點，但其有多個亞基并分別由不同的基因編碼。故I和III型內(nèi)切酶作為工具酶的意義不大，通常所說的限制性核酸內(nèi)切酶即是II 型酶。已經(jīng)從250 多種微生物中分離到約400 種限制性核酸內(nèi)切酶，它們識別的DNA序列一般含4～6 個核苷酸，切割時有的產(chǎn)生平頭末端，有的產(chǎn)生粘性末端。限制性核酸內(nèi)切酶是基因操作中最重要的工具酶。
2.DNA連接酶能將兩個DNA片段拼接起來的酶叫做DNA連接酶。DNA 連接酶不但在DNA復(fù)制(如岡崎片段的連接)和DNA修復(fù)中起作用，在DNA的體外重組中也用于連接兩個DNA的片段。
3.逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶在RNA病毒的復(fù)制中起作用。在分子克隆技術(shù)中利用這種酶的活性將mRNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA(cDNA)，cDNA 比mRNA 穩(wěn)定，易于操作。
4.其他酶類在分子克隆技術(shù)中依據(jù)實驗設(shè)計的需要，可選擇各種其他催化作用不同的酶類。如末端轉(zhuǎn)移酶、DNA聚合酶等。
(二)重組DNA中常用的載體
克隆載體(Cloning Vector)是另一種DNA分子，它能攜帶外源基因(目的基因)進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)復(fù)制和表達?？寺≥d體具有某些遺傳特性，如抗藥性、噬菌斑等。最常用的載體為以下幾種：
1.質(zhì)粒(Plasmid) 是細菌染色體外能自主復(fù)制的小分子DNA，多為環(huán)形雙鏈。質(zhì)粒帶有某些遺傳性狀，如對某些抗生素的抗性?？筛鶕?jù)質(zhì)粒的特性篩選攜帶有目的基因的受體菌。由于質(zhì)粒有自我復(fù)制的能力，質(zhì)粒在細胞分裂時可被保持恒定的傳給子代細胞，能使攜帶的目的基因遺傳下去。最初常用的質(zhì)粒為pBR322。
2.噬菌體(Phage) 由于噬菌體可以感染細菌，并在細菌內(nèi)復(fù)制，故它們也可以作為克隆的載體。常用的噬菌體如λDNA。
3.病毒病毒能感染真核生物，并在宿主細胞中進行復(fù)制。經(jīng)過適當(dāng)改造后可以作為載體。常用的SV40是一種猴病毒。
4.酵母人工染色體(YAC) 這是由酵母基因和質(zhì)粒pBR322人工拼接的載體。這種載體能攜帶大片段DNA(102～103kb)，能在大腸桿菌中復(fù)制，同時帶有酵母基因組的基本功能單位。在人類基因組研究中是很有用的工具。
(三)基因工程的基本過程
基因工程大體可分為以下幾個步驟：目的基因的制備，載體DNA 的選擇及制備，目的基因與載體DNA 在體外重組，重組DNA 分子導(dǎo)入受體細胞，篩選鑒定含有重組分子的受體細胞，擴增重組分子和目的基因的表達與鑒定。
1.目的基因獲得目的基因的常用方法包括：①從染色體DNA經(jīng)限制酶切成所需的DNA 片段; ②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以mRNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，從mRNA合成互補DNA即cDNA; ③較短的核苷酸序列可利用DNA自動合成儀按已知多肽鏈中氨基酸編碼的核苷酸序列，人工合成目的基因; ④利用PCR 技術(shù)，體外擴增所需的目的基因。
2.載體DNA的選擇及制備根據(jù)目的基因的性質(zhì)選擇不同的載體，并將載體純化及用限制性內(nèi)切酶處理。
3.目的基因與載體DNA在體外重組利用DNA連接酶將目的基因及載體DNA在體外連接成重組DNA。
4.重組DNA引入受體細胞通過物理與化學(xué)的方法可將重組DNA引入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)進行表達。重組質(zhì)粒DNA 分子引入受體細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化，重組噬菌體與病毒引入受體細胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。
5.篩選及鑒定利用載體DNA的遺傳標(biāo)記與目的基因的某些特性篩選含有重組子的受體細胞及鑒定重組子。
6.擴增重組子及目的基因表達重組DNA分子在受體細胞中能自主復(fù)制，使目的基因得到擴增，并經(jīng)轉(zhuǎn)錄與翻譯，表達和分泌有生物活性的蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)即為所需要的基因工程產(chǎn)物。
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