1、聚丙烯酰胺的合成和結(jié)構(gòu)
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acrylamide簡(jiǎn)寫為Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(N，N1-methylene-bisacrylamide，簡(jiǎn)寫B(tài)is)在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)成含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族大分子化合物。上海創(chuàng)賽科技提供110-26-9，甲叉雙丙烯酰胺,N,N'-Methylenebisacrylamide,高純,99% ，商品編號(hào)：D23-S14002-100g，價(jià)格158元。
催化劑有兩個(gè)系統(tǒng)可供選用。
(1)過硫酸胺-四甲基乙二胺(N、N、N、N-Tetramethyl-ethylene Diamine，簡(jiǎn)寫TEMED)系統(tǒng)，其中過硫酸銨是引發(fā)劑。它在光照射下裂解成帶有自由基的硫酸銨，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)。TEMED是加速劑，加快引發(fā)劑釋放自由基的速度。
(NH4)2S2O8→→→→→(NH4)2SO4
(2)核黃素-TEMED 系統(tǒng)，其中核黃素是引發(fā)劑，TEMED 是加速劑。這一催化劑系統(tǒng)需較強(qiáng)的光線和少量氧。上海創(chuàng)賽科技提供83-88-5，核黃素，Riboflavine，98%，商品編號(hào)：C16-R10027-100g，價(jià)格395元。
聚丙烯酰胺凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能起分子篩作用。用它作電泳支持物，對(duì)樣品的分離不僅取決于各組分所帶電荷的多少，也與分子大小有關(guān)。凝膠網(wǎng)孔的大小主要受成膠物的總濃度及Acr 和Bis 的比例的影響。一般電泳采用成膠物質(zhì)總濃度為7.5%，此濃度稱為標(biāo)準(zhǔn)凝膠濃度。如果改變總膠濃度，也應(yīng)相應(yīng)改變Acr和Bis的比例。
總膠濃度為5%以下時(shí)，Acr：Bis在20左右。
總膠濃度為5~10%時(shí)， Acr：Bis在40左右。
總膠濃度為5~20%時(shí)， Acr：Bis在125~200左右。
實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)分子量大小，選擇合適的凝膠總濃度和Acr和Bis的比例。
2、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理
不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳是在聚丙烯酰胺凝膠支持物的介質(zhì)緩沖液組成、緩沖液pH、凝膠孔徑和電勢(shì)梯度不連續(xù)的條件下進(jìn)行的電泳。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳有較高的分辨率。這是因?yàn)榉蛛x過程中不僅有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)(存在于分離膠中)，而且還有一種獨(dú)特的濃縮效應(yīng)。下面簡(jiǎn)單介紹不連續(xù)園盤電泳的基本原理：
(1)濃縮效應(yīng)
不連續(xù)園盤電泳一般是在小玻璃管內(nèi)進(jìn)行的。把三種性質(zhì)不完全一樣的聚丙烯酰胺凝膠重疊起來(lái)。如圖4-3所示，上層為樣品膠，中間為濃縮膠，這兩層膠的凝膠濃度為3%是大孔膠，應(yīng)用Tris-HCl 緩沖液，其pH6.7。下層是分離膠，此層凝膠總濃度為7.5%，是小孔膠，也用Tris-HCl 緩沖液，pH8.9。上下電極槽緩沖液是Tris-甘氨酸緩沖液，pH=8.3。通電后，向陽(yáng)極泳動(dòng)的陰離子有三種，即Cl -，蛋白質(zhì)陰離子(Pr -)和甘氨酸陰離子(Gly -)。在樣品膠及濃縮膠pH=6.7 的環(huán)境下HCl 全部電離為Cl-，甘氨酸僅極少部分電離為Gly-(甘氨酸pI=6.0)，一般酸性蛋白質(zhì)也解離為陰離子。這樣，Cl –泳動(dòng)最快(稱快離子)，Gly-泳動(dòng)最慢(稱慢離子)，蛋白質(zhì)介于其間。通電后，快離子很快超過蛋白質(zhì)離子和Gly-，泳動(dòng)到最前面。于是，快慢離子之間形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)域，低電導(dǎo)區(qū)域有較高的電壓梯度。電壓梯度驅(qū)動(dòng)慢離子加速泳動(dòng)。這樣，當(dāng)快慢離子移動(dòng)速度相等時(shí)，就建立一個(gè)不斷向陽(yáng)極移動(dòng)的界面。Pr –的泳動(dòng)速度恰好介于快慢離子之間。因而被擠壓在快慢離子之間形成一條窄帶。這種濃縮作用可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。血清蛋白在紙上電泳和醋酸纖維素薄膜電泳上僅可分成5-7個(gè)組分。而在聚丙烯酰胺凝膠電泳上則可以分為20-30個(gè)組分。
(2)電荷效應(yīng)
蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所帶有效電荷不同，因而泳動(dòng)率也不同，因此各種蛋白質(zhì)就按泳動(dòng)率快慢順序排列成一個(gè)一個(gè)圓盤區(qū)帶。在進(jìn)入分離膠時(shí)，電荷效應(yīng)仍起作用。
(3)分子篩效應(yīng)
當(dāng)被濃縮的蛋白質(zhì)樣品從濃縮膠進(jìn)入分離膠時(shí)，pH值和凝膠孔徑突然改變，選擇分離膠的pH 值8.9 接近甘氨酸的Pka 值(9.7-9.8)，這樣慢離子的解離度增大，因而它的有效泳動(dòng)率也增加。此時(shí)慢離子的有效泳動(dòng)率超過了所有蛋白質(zhì)的有效泳動(dòng)率。這樣，高電勢(shì)梯度不存在了，各種蛋白質(zhì)僅會(huì)由于其分子量或構(gòu)型的不同，在一個(gè)均一的電勢(shì)梯度和pH 條件下，根據(jù)其通過一定孔徑的分離膠時(shí)所受阻滯程度的不同，表現(xiàn)出不同的泳動(dòng)率而被分開。上海創(chuàng)賽科技提供4530-20-5，叔丁氧羰基-L-甘氨酸，≥98.5%，商品編號(hào)：D16-1000956-25g，價(jià)格204元。
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