一、知識(shí)背景：
1、基因表達(dá)：DNA →RNA→Protein
單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因→104個(gè)絲心蛋白mRNA（每個(gè)mRNA存活4d，可以合成105個(gè)絲心蛋白）→共合成109個(gè)絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對(duì)于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。上海創(chuàng)賽科技提供Pfu(高保真DNA聚合酶) ，BR ，商品編號(hào)：D16-1027382-100U，價(jià)格230元。
2、PCR技術(shù)(Polymerase chain reaction)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。上海創(chuàng)賽科技提供143491-57-0|恩曲他濱Emtricitabine>99%,核苷逆轉(zhuǎn)錄酶(NRTI)抑制劑 ，商品編號(hào)：C84-8090-1G，價(jià)格361元。
反應(yīng)分三步：
A、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；
B、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ →3’方向延伸。
以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。
3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR
逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：
1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；
2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；
3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.
二、RT-PCR的準(zhǔn)備：
1、引物的設(shè)計(jì)及其原則：
1）引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對(duì)引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。
2）引物設(shè)計(jì)原則的把握：引物設(shè)計(jì)原則包括
a、引物長(zhǎng)度:一般為15～30bp ，引物太短會(huì)影響PCR的特異性，引物太長(zhǎng)PCR的最適延伸溫度會(huì)超過Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。
b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。
c、3‘端要求：3’端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3’端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的T。
d、引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。
e、引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)，3’端不應(yīng)超過2個(gè)。
f、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。
g、5’端無(wú)嚴(yán)格限制：5’末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。
2、耗材：
實(shí)驗(yàn)所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。
3、試劑準(zhǔn)備：
變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。
三、RNA的提取方法：
RT－PCR中從細(xì)胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白R(shí)nasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。上海創(chuàng)賽科技提供RNA酶抑制劑，RNasin Inhibitor，商品編號(hào)：B11000504-1000u，價(jià)格118.3元。
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