外泌體早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中，是細(xì)胞主動分泌，大小較為均一，直徑為30~100納米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡樣小體。隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，生物學(xué)界對外泌體的探索日趨深入。2013年，三位國外科學(xué)家因在細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究上取得關(guān)鍵性突破，被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。由此，外泌體的研究達(dá)到了一個全新的高度。
而近年來，越來越多的證據(jù)顯示出外泌體對臨床治療的重要價值。外泌體是細(xì)胞間信使，通過其數(shù)量和生物化學(xué)組成的變化，可為進(jìn)一步的臨床診斷提供有力的證據(jù)。它攜帶多種蛋白質(zhì)和miRNA，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長等過程，并且有可能成為藥物的天然載體，應(yīng)用于腫瘤檢測或臨床治療。
但目前國內(nèi)在外泌體研究方面的經(jīng)驗(yàn)十分有限，無論是離心法、過濾離心還是免疫磁珠法，都無法同時保證外泌體的含量、純度以及生物活性。這首先就制約了外泌體樣本的制取，進(jìn)而對后續(xù)的表征造成困難。而測量技術(shù)的局限性也大地阻礙了外泌體在這些領(lǐng)域的研究進(jìn)展。
為了與國際先進(jìn)水平接軌，同時推動中國醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展，使更多中國患者獲得康復(fù)良機(jī)，廣州某三級甲等醫(yī)院抓住國內(nèi)外泌體研究的先機(jī)，于今年啟動了針對骨髓瘤的外泌體表征工作。但是首先，他們在研究設(shè)備的選擇上犯了難。
在當(dāng)前中國市場主流的外泌體表征方法中，研究人員的選擇一般有電子顯微鏡、流式細(xì)胞儀和動態(tài)光散射技術(shù)。但電子顯微鏡一次只能觀測數(shù)量有限的顆粒，在代表性上存在嚴(yán)重不足，同時，由于電子顯微鏡的樣本制備過程比較復(fù)雜，因此很容易造成樣本的形態(tài)、狀態(tài)發(fā)生改變;流式細(xì)胞儀目前的測量顆粒粒徑下限為300nm左右，大大超過了外泌體的粒徑上限;而動態(tài)光散射技術(shù)不適合多分散的復(fù)雜外泌體樣本的測量，且無法得出樣品中外泌體的濃度。
后來，經(jīng)過對國際上的研究設(shè)備進(jìn)行慎重分析和比對，該醫(yī)院開始留意英國馬爾文儀器有限公司(以下簡稱“馬爾文”)的產(chǎn)品。作為全球材料和生物物理表征領(lǐng)域的企業(yè)，馬爾文為全球眾多客戶提供高性能的粒度表征解決方案，在業(yè)界享有盛譽(yù)。特別是其采用了全新一代納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(馬爾文技術(shù)，以下簡稱NTA)的NanoSight產(chǎn)品系列，可以直接并實(shí)時觀測納米顆粒，通過光學(xué)顯微鏡收集納米顆粒的散射光信號，拍攝其在溶液中做布朗運(yùn)動的影像，再對每個顆粒的布朗運(yùn)動進(jìn)行追蹤和分析，從而計算出納米顆粒的流體力學(xué)半徑和濃度。這一新穎的納米顆粒表征方法立即吸引了該家醫(yī)院。果然，馬爾文沒有讓他們失望。
完善功能全方位響應(yīng)客戶需求
從接洽到接受NTA技術(shù)，僅在短短的3個月內(nèi)該醫(yī)院就決定采用馬爾文NanoSight系列型號的產(chǎn)品——NS 300納米顆粒跟蹤分析儀(以下簡稱“NS 300”)。對此次合作，馬爾文NanoSight產(chǎn)品專家梅潔先生表示：“說服客戶的不是我們的專家，而是馬爾文的產(chǎn)品本身。”
在為該醫(yī)院提供詳細(xì)的設(shè)備培訓(xùn)后，馬爾文NS 300便馬上投入到了研究使用中。很快，它憑借高效的性能和方便快捷的操作獲得了客戶研究團(tuán)隊(duì)的普遍認(rèn)可。
出色的質(zhì)控作用
外泌體的提取一直以來都是橫亙在所有相關(guān)研究者面前的一道難題。生物細(xì)胞中的囊泡種類繁多，怎樣證明提取的顆粒一定就是外泌體呢?電子顯微鏡在鑒定一定數(shù)量的顆粒屬性方面固然有效，但如前所述，電子顯微鏡不適合對大量顆粒進(jìn)行快速分析，而動態(tài)光散射技術(shù)又只能對分布相對均一的樣本顆粒進(jìn)行檢測，并且不具備熒光功能。
配備了先進(jìn)NTA檢測技術(shù)的馬爾文NS 300在這時便體現(xiàn)出強(qiáng)大的功能：它能夠進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控，通過對觀察到的所有顆粒進(jìn)行分析和計算，時間給出樣本粒度的詳細(xì)分布和濃度的具體信息。同時，研究人員還可以利用熒光標(biāo)定重點(diǎn)的特定外泌體顆粒，從四種不同波長——405nm、 488nm、 532nm和635nm——的激光器中選擇一款，搭配相應(yīng)的濾光片，從而實(shí)現(xiàn)對熒光樣品的測量，再由NTA技術(shù)對其進(jìn)行單獨(dú)檢測，免受復(fù)雜樣本(如血清、尿液等)環(huán)境的影響。對復(fù)雜樣品的分辨能力對于像外泌體這樣的研究對象來說至關(guān)重要。
尤為關(guān)鍵的是，由于NTA的工作原理是通過將一束能量集中的激光穿過玻璃棱鏡對樣品(懸浮顆粒的溶液)進(jìn)行照射，配以玻璃表面鍍鉻使背景信號小化，可讓研究人員通過顯微鏡直接觀察到納米顆粒在溶液中的布朗運(yùn)動，并拍攝影像，對每個顆粒的布朗運(yùn)動進(jìn)行追蹤和分析，快速準(zhǔn)確地計算出樣本中納米顆粒的流體力學(xué)半徑和濃度。相對于其他傳統(tǒng)技術(shù)，NTA能對懸浮液中粒徑范圍為10nm-2000nm的顆粒進(jìn)行全方位表征，并且兼具高的分辨率，對于粒度較為接近的顆粒仍然可以準(zhǔn)確分析，特別適用于外泌體、蛋白質(zhì)聚集、藥物傳輸、納米顆粒毒理、病毒和疫苗等復(fù)雜體系的相關(guān)研究。
另外，馬爾文NanoSight還可以測定顆粒的數(shù)量，準(zhǔn)確指示樣本溶液中的單位體積顆粒濃度和顆粒數(shù)量，進(jìn)行以量為基準(zhǔn)的粒徑測試和分布測試。對于客戶可能存在的樣本量不足的研究情況，馬爾文NS 300也能通過支持低濃度測試(可達(dá)到300微升)幫助實(shí)現(xiàn)既定監(jiān)測目標(biāo);而同樣的條件，傳統(tǒng)電子顯微鏡很難實(shí)現(xiàn)有效的統(tǒng)計學(xué)分析。
操作簡便、工作效率高
通常，大型儀器(如流式細(xì)胞儀)在使用前都需要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)熱和校準(zhǔn)準(zhǔn)備。馬爾文NS 300則無需這樣做，它只要連上電源就能直接使用。并且由于NTA技術(shù)采用的是斯托克斯-愛因斯坦方程的計算，所提供的是一個無關(guān)質(zhì)量、折光度和顆粒材料的流體力學(xué)直徑，因此儀器可跳過繁瑣的校準(zhǔn)直接進(jìn)入研究分析，為工作人員節(jié)省研究前的時間。
作為一種集成程度和自動化程度都非常高的儀器，馬爾文NS 300除了將軟硬件設(shè)備、攝像頭和顯微鏡等集于一體，還整合了顆粒檢測功能與納米顆粒分析技術(shù)，為納米顆粒表征提供易于使用的可重復(fù)平臺。40cm x 25cm的設(shè)備主機(jī)集成了超高靈敏度科研級sCMOS光電傳感器、溫控單元和一個具有四種可選波長的激光。樣品池和激光模塊也能輕易的拆卸和組裝，便于移動、清潔，適合高通量檢測。強(qiáng)大的軟件分析能力讓馬爾文NS 300在短的時間內(nèi)就能繪制出粒徑—對應(yīng)數(shù)量分布強(qiáng)度—顆粒散射光強(qiáng)的三維圖譜，并得出與各種粒徑顆粒有關(guān)的全面信息。這樣不僅減少了人為操作失誤的概率，更大大提高了研究人員的工作效率。
據(jù)該客戶介紹，在使用馬爾文儀器NS 300之前，原本使用流式細(xì)胞儀做4個實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，可能要花一個下午的時間，而現(xiàn)在用馬爾文NS 300，一個小時就能輕松搞定，且分析結(jié)果全面、可靠。對他們來說，這不光節(jié)約了大量的時間，加速推進(jìn)整個科研進(jìn)程，還為醫(yī)院節(jié)省了寶貴的人力成本。
“市面上常見的表征儀器往往只具有單一的功能，無法滿足我們?nèi)轿坏囊?，之所以后選擇馬爾文NS 300也正是考慮到它在功能上的完善。可以說，到目前為止，NS 300給我們提供了很大的幫助?！痹撫t(yī)院血液科某唐姓醫(yī)生表示。
增值服務(wù)保障產(chǎn)品狀態(tài)
作為顆粒物表征技術(shù)的市場領(lǐng)導(dǎo)者，馬爾文不斷把行業(yè)中的技術(shù)帶到中國，讓客戶買到的不只是一個硬件，而是一整套解決方案。除了技術(shù)創(chuàng)新，馬爾文也一貫注重客戶服務(wù)，其技術(shù)團(tuán)隊(duì)人數(shù)是銷售團(tuán)隊(duì)的3倍，涵蓋了學(xué)術(shù)級專家、應(yīng)用專家和服務(wù)工程師等，他們會參與客戶的研究工作，深入了解客戶需求，為其提升產(chǎn)品價值。
在此次合作中，除了高品質(zhì)的產(chǎn)品，馬爾文所提供的專業(yè)的應(yīng)用支持，也是該醫(yī)院選擇馬爾文的關(guān)鍵原因。在設(shè)備采購的溝通階段，馬爾文就為客戶提供了細(xì)致的產(chǎn)品咨詢，幫助他們根據(jù)具體的研究需要采購設(shè)備。而在開始使用階段，馬爾文也安排了專業(yè)的指導(dǎo)培訓(xùn)，并針對客戶的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用環(huán)境給出許多專業(yè)建議，幫助客戶迅速熟悉設(shè)備，滿足特定實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)的需求，更快、更好、更有針對性地獲得技術(shù)表征結(jié)果。
在售后階段，馬爾文的工程師們也為該醫(yī)院提供了全面的維修和維護(hù)服務(wù)，快速響應(yīng)他們的要求，幫助他們診斷并解決設(shè)備在使用過程中遇到的問題，確保儀器始終處在的工作狀態(tài)，提升客戶滿意度。
總結(jié)與展望
在馬爾文NS 300的幫助下，該醫(yī)院的外泌體研究表征上目前已取得了初步進(jìn)展，以有力的證據(jù)驗(yàn)證了正常組織細(xì)胞和腫瘤組織細(xì)胞在外泌體粒徑及粒徑分布濃度上的差異。目前，更多實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行過程中，相信有馬爾文NS 300的鼎力支持，不久的將來會有更多科研進(jìn)展呈現(xiàn)。
雖然外泌體作為生物標(biāo)志物的研究在國內(nèi)尚處于起步階段，但它在臨床治療領(lǐng)域已顯現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿?。在臨床診斷中，簡單快速地在復(fù)雜生物背景下測量外泌體濃度、粒徑是必備要求，目前存在的方法都無法完美地解決這一問題。NTA作為一項(xiàng)全新的測量技術(shù)，具有實(shí)時觀測和熒光測量功能，能夠以較高的分辨率，準(zhǔn)確地測量顆粒濃度，從而為外泌體大小和濃度研究提供新的思路。而隨著越來越多科研機(jī)構(gòu)與研究項(xiàng)目成果的進(jìn)一步披露，以馬爾文NanoSight為代表的新一代NTA技術(shù)將會為推進(jìn)外泌體研究乃至人類健康事業(yè)的發(fā)展做出更大貢獻(xiàn)。
