PEG 400等藥物賦形劑通常被加入到制劑中以促進(jìn)其在介質(zhì)中溶解。然而，這些化合物卻可引發(fā)顯著的基質(zhì)效應(yīng)，尤其是在LC/MS/MS分析中產(chǎn)生的離子抑制效應(yīng)。常規(guī)藥物研發(fā)流程中使用的快速LC梯度方法，容易導(dǎo)致此類化合物和目標(biāo)分析物的共流出。由于這種共流出物已被證實(shí)是導(dǎo)致離子抑制效應(yīng)的主要原因，因此在早期藥代動(dòng)力學(xué)(PK)研究中，賦形劑濃度偏高可能會(huì)帶來棘手的問題1-3。為盡量減少這一問題引發(fā)的不良影響，目前已研究出的方法包括：LC梯度調(diào)節(jié)2,3，分析色譜柱的選擇1，樣品制備策略的方法開發(fā)1-3，樣品稀釋5，甚至是全新制劑藥的開發(fā)4。即便其中部分方法已取得成效，他們也存在各自的局限性。很顯然，分析員通常無法自己選擇制劑藥賦形劑。無論是改變梯度或流動(dòng)相，還是色譜柱的選擇，LC條件的優(yōu)化都能夠針對(duì)部分分析物解決這一問題，但它既無法應(yīng)用到全部分析物，也需要更多的方法開發(fā)作為輔助支持。同時(shí)，對(duì)LC運(yùn)行條件的過多優(yōu)化并不利于高通量分析。有研究人員指出， “若能開發(fā)出一種更優(yōu)化的固相萃取(SPE)方法，便可實(shí)現(xiàn)有效的凈化效果。 ” 3
針對(duì)以上問題，本應(yīng)用紀(jì)要通過使用Oasis復(fù)合模式陽離子交換(MCX)SPE方法提供了一種可以快速、便捷、高效的解決方案。堿性分析物通過強(qiáng)陽離子交換作用被吸附在填料中，而如PEG等非離子型的賦形劑則通過反相機(jī)理被吸附，同時(shí)能夠在分析物洗脫之前被選擇性去除。
實(shí)驗(yàn)
樣品制備
標(biāo)準(zhǔn)品包含：醋丁洛爾、美托洛爾、拉貝洛爾、咪達(dá)挫侖。這些成分分別加入到空白血漿中、調(diào)整其濃度至200 ng/mL，或是后加標(biāo)到萃取后的空白血漿洗脫液中，用于回收率的計(jì)算。PEG400也是分別加入到空白血漿中調(diào)整其濃度到到5mg/mL或者后加標(biāo)到萃取后的空白血漿洗脫液中用于確定回收率。
樣品按照Oasis® MCX的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行萃取。簡單來說，在0.5mL兔血漿中加入0.5mL 4% H3PO4進(jìn)行酸化。(注意：本研究中采用的是0.5mL血漿，采用更小劑量亦可)。MCX96孔板在經(jīng)過1.0mL MeOH和1.0mL H2O活化平衡之后，經(jīng)酸化的樣品被上樣到填料中.上樣后，使用1.0mL 2%甲酸和2×1.0 mL MeOH清洗。樣品使用2×250μL含5%NH4OH的MeOH溶液進(jìn)行洗脫。 “后加標(biāo)”(PS)樣品是在空白兔血漿洗脫液中加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)品與PEG 400的混合物。經(jīng)萃取的樣品則
以以下方式制備：在未經(jīng)萃取的血漿中加入200ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品、或在其基礎(chǔ)上再加入5 mg/mL PEG 400。
PEG去除的回收率依據(jù)以下算式得出：% 回收率 =(萃取樣品峰面積/后加標(biāo)樣品峰面積)×100%
為進(jìn)行PEG去除的相關(guān)分析，樣品按照1:200的比例在流動(dòng)相中進(jìn)行稀釋，以避免高濃度PEG400給質(zhì)譜儀帶來的污染。
方法條件
SPE條件
SPE板： Oasis MCX 96孔板30 μm (30 mg)，部件編號(hào)：186000248
液相色譜條件
液相色譜系統(tǒng)：沃特世ACQUITY UPLC系統(tǒng)
檢測：沃特世ACQUITY® SQD
樣品瓶：2 mL 96孔收集板;部件號(hào) WAT058958
色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm，2.1 x 50 mm，部件號(hào)：186002350
柱溫： 30攝氏度
樣品溫度：10攝氏度
進(jìn)樣量：10μl
流速： 0.5 mL/min.
流動(dòng)相A(MPA)：0.1% HCOOH水
流動(dòng)相B (MPB)：0.1% HCOOH乙腈
初始流動(dòng)相條件為95:5 MPA:MPB。持續(xù)0.5分鐘，MPB在2.5分鐘之后增至90%。MPB比例隨后降回5%，并持續(xù)2分鐘，重新平衡色譜柱?？傔\(yùn)行時(shí)間5.0分鐘。
質(zhì)譜條件
質(zhì)譜系統(tǒng)： 沃特世ACQUITY SQD
電離模式： (+) ESI
采集范圍： SIR
毛細(xì)管電壓：2.5 kV
錐孔電壓： 根據(jù)化合物有所區(qū)別 (針對(duì)不同分析物進(jìn)行優(yōu)化)
脫溶劑氣體：700 L/min
錐孔氣： 0 L/min
數(shù)據(jù)管理
色譜系統(tǒng)： MassLynx®V4.1 SCN714和MS軟件
結(jié)果與討論
PEG 400及其他四種測試化合物的色譜圖如圖1所示。圖中寬峰是PEG400豐度較大的分子離子峰的綜合TIC，包括以下分子量的PEG單峰：370、414、458、502、546、590和634。標(biāo)準(zhǔn)品(醋丁洛爾、美托洛爾、拉貝洛爾、咪達(dá)挫侖)可通過MH+離子的SIR顯示，除咪達(dá)挫侖，它的MH+離子與(MH-35)+ 離子合并成一個(gè)峰。值得注意的是，醋丁洛爾和美托洛爾均與PEG發(fā)生共流出，因而二者更容易受到血漿樣品中殘留PEG產(chǎn)生的離子抑制的影響。圖2為PEG的兩個(gè)色譜圖。A圖顯示未經(jīng)過SPE處理的血漿樣品中PEG含量情況。它是將PEG后加標(biāo)至萃取的最終血漿洗脫液中得到的。B圖則為含有5 mg/mL PEG的血漿樣品經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)MCX流程萃取得到的，該圖表明血漿樣品中幾乎全部PEG 400都得以去除。圖3顯示為實(shí)驗(yàn)所用樣品組的平均PEG峰面積，如圖所示，采用MCX萃取，超過99%的PEG 400得以去除。
按照前文方法的方程式計(jì)算分析物回收率。如圖4A所示，采用標(biāo)準(zhǔn)MCX流程后，每種分析物的回收率都超過80%。而對(duì)這四種分析物而言，平均回收率則達(dá)到95%。如圖4B所示，血漿中含有的5 mg/mL PEG 400對(duì)于分析物回收率并無影響。在含有PEG的情況下，平均回收率為103.6%。
將PEG 400從血漿中去除的主要目的就是為了清除可能引發(fā)的離子抑制效應(yīng)。圖5為由下面方程式得出的基質(zhì)效應(yīng)數(shù)據(jù)一覽，據(jù)最新AAPS論文報(bào)道6。
基質(zhì)效應(yīng) =(含PEG的峰響應(yīng)值/不含PEG的峰響應(yīng)值)
圖表A所示數(shù)據(jù)來源于經(jīng)Oasis MCX萃取去除PEG的血漿樣品。圖表B所示數(shù)據(jù)來源于經(jīng)萃取后又加入PEG的血漿樣品，可以看到在樣品制備過程中未去除PEG的結(jié)果。由圖顯示，若未去除PEG，醋丁洛爾和美托洛爾受到嚴(yán)重的離子抑制作用影響，基質(zhì)效應(yīng)因子分別為0.45和0.77。由上述數(shù)據(jù)可以清晰看出，那些與PEG峰共流出的分析物，使用Oasis MCX SPE板去除PEG后，離子抑制效應(yīng)能得以有效清除。經(jīng)PEG去除后，最終醋丁洛爾和美托洛爾的基質(zhì)效應(yīng)因子分別為0.93和1.04。
結(jié)論
Oasis MCX 96孔板提供了一種用于去除血漿樣品中高濃度PEG的簡便、快捷、高效的方法，從而消除早期藥代動(dòng)力學(xué)研究中常見的基質(zhì)效應(yīng)(通常是離子抑制效應(yīng))。此外，該解決方案無需進(jìn)行色譜分析方法的再開發(fā)、樣品的稀釋、及其他費(fèi)時(shí)費(fèi)力的流程即可成功解決上述問題，這使得整個(gè)解決方案廣泛適用于高通量分析的應(yīng)用。
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